【佳學基因檢測】男性生殖遺傳學基因檢測標準與專家共識
遺傳病、罕見病基因檢測導讀：
本文內容賊初發(fā)表于《中華男科學雜志》， National Journal of Andrology Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi 2015，21( 12) : 1138 － 1142。 轉載于此是出于傳播男性生殖遺傳學的診斷標準，普及男性生殖的科學知識。并不代表本網站有效贊同和使用里面的知識和觀點。
遺傳學異常是臨床上導致男性不育的重要因 素。隨著生殖醫(yī)學及男科學專業(yè)的發(fā)展，很多既往 認為只能供精輔助生育的患者，如 Klinefelter 綜合 征等，有可能通過睪丸顯微取精術行輔助生殖技術 ( ART) 助孕，這對臨床傳統(tǒng)治療思路提出了挑戰(zhàn); 另外，新的檢測技術發(fā)展迅速，為臨床疾病病因診斷 提供了強有力的手段，但目前臨床上存在著男性生 殖遺傳學檢查適應證不明確、方法良莠不齊、結果解 讀及處理不規(guī)范等問題，為規(guī)范男性生殖遺傳學檢 查在臨床中的應用，中華醫(yī)學會男科學分會組織專 家共同研究并制定本共識，旨在為臨床醫(yī)師提供指 導和參考。
概述
遺傳學檢查在男性生殖疾病診治中的應用非常 重要，開展男性生殖遺傳學檢查，對于指導臨床治 療、提高輔助生殖技術的療效和安全性、開展胚胎植 入前遺傳學診斷( PGD) 等具有重要意義，可選擇染 色體核型分析、Y 染色體微缺失等常規(guī)檢查以及基因突變檢測等特殊檢查。
遺傳學檢查技術發(fā)展突飛猛進，許多新技術逐漸用于臨床，如多重連接探針擴增( MLPA) 技術可檢測染色體數(shù)目異常、基因缺失和重復等; 基因多態(tài)性分析可預測男性不育患病風險并指導個體化用 藥; 精子發(fā)生過程中涉及許多表觀遺傳學調控，檢測 DNA 甲基化、組蛋白修飾和非編碼 RNA( ncRNA) 等［1］; 近年來，具有高靈敏度、高通量、高分辨率等 特點的基因測序技術開始應用于臨床，可檢測一些基因組疾病，包括拷貝數(shù)變異( CNV) 等。比較基因 組雜交( CGH) 技術可用于檢測某些不平衡的染色體畸變［1］。這些新技術的應用將進一步豐富男性生殖遺傳學檢查內容，為臨床診斷和治療提供參考。
1． 1 染色體核型分析
染色體核型分析是賊常用的男性生殖遺傳學檢查技術。不育男性染色體異常發(fā)生率顯著高于正常生育力男性。男方染色體核型 異常，如染色體平衡易位，與不育和配偶反復自然流產有關［2］。20 世紀 70 年代，高分辨 G 顯帶技術開 始在臨床應用，目前已成為染色體核型分析的常規(guī) 檢查方法［3］。熒光原位雜交( FISH) 技術可用于對 一些異常核型的明確診斷。
1． 2 Y 染色體微缺失檢測
Y 染色體長臂上存在控制精子發(fā)生的基因，稱為無精子因子( azoospermia factor，AZF) ; 1996 年 Vogot 等 將 AZF 分 為 AZFa、 AZFb、AZFc 3 個區(qū)域，1999 年 Kent 等認為在 AZFb 區(qū)與 c 區(qū)之間還存在 AZFd 區(qū)。AZF 的缺失或突變 可能導致精子發(fā)生障礙，引起少精子癥或無精子 癥［4］。Y 染色體微缺失目前主要是指 AZF 缺失，研究認為，在無精子癥和少精子癥的患者中，AZF 缺失者約占 3% ～ 29% ，發(fā)生率僅次于 Klinefelter 綜合 征，是居于第 2 位的遺傳因素［4］。目前，Y 染色體微 缺失的常用檢測方法包括實時熒光定量 PCR 法、多 重 PCR-電泳法等［5］。
1． 3 基因突變檢測
目前已知 CFTR( cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator factor) 基因突變可引起 囊 性 纖 維 化 ( cystic fibrosis，CF; OMIM 219700) ［6］和先天性雙側輸精管缺如( Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens，CBAVD; OMIM 277180) ［7］。此外研究還發(fā)現(xiàn)它與慢性胰腺炎［8-10］、 睪丸生精功能障礙［11］、精子受精功能障礙［12］、女性生殖能力［13］等多種疾病相關，甚至與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展相關［14］。已有研究發(fā)現(xiàn)存在 CFTR 基因突變 的 CBAVD 患 者 ART 時有更高的流產、死胎風險［15］。AURKC 基因突變會導致大頭多鞭毛精子 癥［16］，DPY19L2 基因異常會導致圓頭精子癥［17］， 雄激素受體( AR) 基因突變會引起雄激素不敏感綜 合征( AIS) ［18］，5α 還原酶( SRD5A) 基因突變可能會導致 46，XY 男性性發(fā)育異常［19］等。地中海貧血是 由于人類珠蛋白基因的突變引起，包括 α 和 β 兩種 類型，α 地中海貧血的胎兒，在孕中晚期易出現(xiàn)宮內死亡或早產后死亡等不良妊娠結局; β 地中海貧血 可導致胎兒死亡或殘疾［20-21］。針對廣西、廣東和海南等地中海貧血高發(fā)地區(qū)全體人群及曾生育過地中海貧血患兒的育齡夫婦，進行地中海貧血基因突變 檢測，同時配合 PGD 或其他產前診斷可預防地中海 貧血患兒出生。因此，有必要針對上述患者進行特 定基因突變篩查和遺傳咨詢，指導臨床治療。
2 染色體異常
2． 1 檢查指征及檢測方法
當精子發(fā)生異常、性發(fā)育異常、配偶反復不良妊 娠、體 外 受 精-胚 胎 移 植 ( IVF-ET) 前準備以及一些特殊情形時，通常應進行 染色體核型分析，必要時行其他遺傳學檢查。染色體分析通常使用染色體顯帶技術來進行核型分析。
2． 2 染色體異常類型、臨床表型及處理策略
染色體異常通常分為數(shù)目異常和結構異常。染色體數(shù)目異常包括染色體整倍體異常、性染色體數(shù)目異常和常染色體數(shù)目異常。男科臨床染色體數(shù)目異常以性染色體數(shù)目異常為多見，常染色體數(shù)目異常較為少 見，而染色體整倍體異常者大都出生后死亡。本共識著重介紹性染色體異常的臨床特征及處理策略。
2． 2． 1 Klinefelter 綜合征( Klinefelter syndrome) 的 臨床特征及處理策略
Klinefelter 綜合征也稱克氏 綜合征或 XXY 綜合征，是男性患者細胞中多出 1 條 X 染色體所致。多出的 X 染色體導致生精細胞發(fā)育障礙。位于 X 染色體上逃避 X 染色體的基因劑量效應可能是遺傳病理之一。Klinefelter 綜合征的常見核 型 為 47，XXY，占 80% ～ 85% ，嵌 體 ( 47，XXY/46，XY) 約 占 15% ，其 余 為 48，XXXY、 49，XXXXY等?；颊咄ǔＩ聿母叽? 與父母相比) ， 第二性征發(fā)育異常，體征女性化，男性乳房發(fā)育，胡 須及陰毛稀少，陰莖小，睪丸體積小，睪酮低下和不 育。可伴有多種出生缺陷，如隱睪、尿道下裂、腹股溝疝、腭裂等。成年后易發(fā)生多種合并癥，如糖尿病、代謝綜合征、肥胖和骨質疏松等。Klinefelter 綜合征的表型隨著 X 染色體數(shù)目的增加而加重，主要表現(xiàn)在機體發(fā)育嚴重畸形和智力低下。
Klinefelter 綜合征涉及多學科綜合治療，主要涉及生長發(fā)育及生育治療。隨著輔助生殖技術的發(fā) 展，許多 Klinefelter 綜合征患者可通過輔助生殖技術獲得子代。大多數(shù) Klinefelter 綜合征患者臨床表 現(xiàn)為無精子癥，少數(shù)患者可表現(xiàn)為隱匿精子癥或重度少精子癥，有些嵌合比例低的個體甚至可以有幾 乎正常的精子發(fā)生，并有自然生育子代的報道。大 約 40% ～ 70% 臨床表現(xiàn)為無精子癥的非嵌合型 Klinefelter 綜合征患者通過睪丸顯微取精術能獲得 精子，通過體外受精-胚胎移植生育子代［22-24］。
已有的研究表明，Klinefelter 綜合征患者精子的異常核型從 0% ～ 21． 7% 不等，個體之間存在差異。 因此，大多數(shù)的精子核型是正常的，多數(shù)患者性染色體異常的精子比例低于 5% ，低于理論上的 50% 。 但考慮到 Klinefelter 綜合征患者精子性染色體和常染色體異常的比例仍較正常生育人群高，其正常胚 胎的比例也較正常生育組低( 54． 0% vs 77． 2%) ［25］，必 要時建議考慮行 PGD 或產前診斷［25-27］。
2． 2． 2 47，XYY 綜合征的臨床特征及處理策略
47，XYY 綜合征患者通常身材高大，智力正?；蜉p度低下，性格孤僻，易發(fā)生攻擊行為，生育力正常至 無精子癥均可發(fā)生。 47，XYY 理論上可形成 4 種類型的精子( X、Y、 YY、XY) ，但實際上異常核型精子比例很低，通常不超過 1% ，因此臨床上通常按常規(guī)程序處理。
2． 2． 3染色體結構異常的分類及處理策略
常見的染色體結構異常有易位、倒位、缺失、重復、插入、 環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體和微結構異常等。導致染色體結構異常的遺傳學基礎是染色體的斷裂和斷裂后染色體斷端的異常重接。隨著分子細胞遺傳學技術的發(fā)展，用常規(guī)的染色方法不能或難以被發(fā)現(xiàn)的染色體結構異常，也能得以發(fā)現(xiàn)并診斷。 當染色體結構異常患者產生不平衡精子時，多數(shù)胚胎通常很難存活，將導致流產或死胎。此類患者通常要借助輔助生殖技術，進行 PGD 生育子代。 某些染色體結構變異患者產生精子的情況與理論值有差異，如臨床多見的 9 號染色體臂間倒位，其產生的正常核型精子比例通常較高，但也不能有效忽視產生異常胚胎的風險。
3 Y 染色體微缺失
3． 1 Y 染色體微缺失篩查指征、檢測位點及方法
Y 染色體微缺失目前主要是指 AZF 微缺失。Y 染 色體上影響精子發(fā)生的 AZF 區(qū)域，可分為 AZFa， AZFb，AZFc 等區(qū)域。非梗阻性無精子癥、嚴重少精 子癥患者，建議進行 Y 染色體微缺失檢測。原因不明的男性不育患者可選擇性行 Y 染色體微缺失檢測。AZF微缺失能垂直遺傳，有相關家族史者，建議 進行篩查［4-5］。
目前，檢測 AZF 微缺失推薦以下 8 個位點為包含位 點。sY84 及 sY86、sY127 及 sY134、sY254 及 sY255、sY145 及 sY152 ［4-5，28-30］。
以前 Y 染色體 AZF 微缺失的臨床實驗室診斷方法是利用外周血標本行多重 PCR-電泳法，該技術耗時長，結果判定的主觀性大，還存在交叉污染的風 險。隨著技術的進展，建議應用實時熒光定量 PCR 技術，靈敏度高、特異性好、檢測速度快，同時，必須加強臨床檢驗過程中的質量控制［5］。
3． 2 Y 染色體微缺失的臨床處理策略
3． 2． 1 AZFa 區(qū)域缺失
通常導致唯支持細胞綜合征( SCOS) ，臨床表現(xiàn)為睪丸體積的縮小、無精子癥 等。AZFa 區(qū)域有效缺失合并無精子癥者，建議供精人工授精( artificial insemination by donor，AID) 。
3． 2． 2 AZFb 區(qū)域缺失
患者睪丸組織病理學表現(xiàn)為精子發(fā)生阻滯，主要停留在精母細胞階段，AZFb + c 缺失會導致 SCOS 或精子發(fā)生阻滯，患者多為無精子癥，故 AZFb 有效缺失( 含 AZFb + c 缺失) 的無精子癥者，建議供精 AID。
3． 2． 3 AZFc 區(qū)域缺失
單獨AZFc 缺失患者可以表現(xiàn)為正常精子數(shù)目、少精子癥及無精子癥，AZFc 微缺失可以遺傳給其男性后代。對于 AZFc 區(qū)缺失的無精子癥患者，可以行睪丸手術取精獲得精子行 ICSI。對于 AZFc 區(qū)缺失合并嚴重少精子癥患者，可 以直接 ICSI，助孕時建議行 PGD 生育女孩，以避免 遺傳缺陷的垂直傳播。另外，有研究發(fā)現(xiàn) AZFc 區(qū)域缺失的少精子癥患者，其精子數(shù)目有進行性下降 的趨勢，賊后發(fā)展為無精子癥。因此，對此類患者建議及早生育或冷凍保存精子。
3． 2． 4 sY145 及 sY152
有研究報道 sY145 及 sY152 可能與精子形態(tài)異常相關，缺失可能導致少精子癥或者精子形態(tài)異常［28-29］。但目前尚缺乏國人大樣本 ( 包括正常生育人群及無精子癥患者) 的研究數(shù)據(jù)，故 sY145 及 sY152 的臨床意義尚需進一步研究，建議參 考已發(fā)表的相關文獻，對該位點與臨床表型之間的關系及相應的睪丸組織病理學特征進行深入研究，為男 性不育患者提供更加全面的遺傳學診斷。
4 CFTR 基因檢測
4． 1 CFTR 基因突變檢測指征
CBAVD 是男性不育和梗阻性無精子癥的重要原因，患者除自覺精液量少之外多無其他癥狀，精液化驗精液量少，pH 值低( ＜ 6． 4) ，精漿果糖陰性，彩超多提示附睪網格狀回聲、附睪發(fā)育不良、雙側精囊腺發(fā)育不良等，少數(shù)病例合并腎臟發(fā)育畸形或缺如［14］。對于存在以上 情況疑診 CBAVD 的患者建議進行 CFTR 基因檢測。
4． 2 CFTR 基因檢測方法
目前已知的 CFTR 基因突變有 2 000 多種，并且還在不斷增加［31］。理想的突變檢測方式是采集外周血對整個 CFTR 基因( 包 括啟動子區(qū)) 進行測序。但限于目前還缺乏中國人群大樣本的研究數(shù)據(jù)［32-35］，建議可以先從已知突變位點著手開展，未來再借助高通量測序的方法更為全面、有效地檢測出基因突變和多態(tài)性位點。
4． 3 CFTR 基因突變處理策略
如果男方存在 CFTR 基因突變，建議進行遺傳咨詢，避免子代的遺傳學風險。
5 精子 DNA 完整性檢測
精子 DNA 完整性是親代將遺傳物質正確傳遞給子代的前提，在受精和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。精子 DNA 完整性檢測反應了精子 DNA 的損傷程度，研究表明精子 DNA 的損傷與男性不育、自 然妊娠率的降低和反復流產可能有關［37-38］。臨床 上引起精子 DNA 損傷的主要病因包括①精索靜脈 曲張、睪丸炎、附睪炎和生殖器腫瘤等疾病; ②激素、 放、化療藥物及免疫抑制劑等藥物的使用; ③抽煙、 酗酒等不良生活習慣及農藥、重金屬等環(huán)境污染物; ④年齡或心理因素等［39］。
5． 1 精子 DNA完整性檢測的適應證
①女方反復 自然流產、胚胎停育等的男性不育患者; ② 采 用 ART 多次未成功的男性不育患者; ③排除女方因素 的特發(fā)性男性不育患者( 無精子癥除外) 推薦進行; ④大齡、擬行 ART 助孕者及育前優(yōu)生體檢者可選擇 性檢查。
5． 2 精子 DNA完整性檢測方法
由于目前檢測方法較多，且各有優(yōu)劣。常見技術包括精子染色質結構分析試驗( SCSA) 、彗星試驗/單細胞凝膠電泳 ( SCGE) 和精子染色質擴散試驗( SCD) 、熒光原位雜 交技術( FISH) 等［40］。SCSA 法成本相對較高，且需 要使用流式細胞儀檢測，對實驗室條件要求較高，但檢測中分析5 000條精子，能更加穩(wěn)定正確地反映精子 DNA 損傷的真實狀態(tài); SCD 法只需使用光學顯微 鏡，檢測快速且成本相對較低，但檢測結果易受主觀 分析影響，檢測人員的經驗和熟練程度尤為重要。 目前使用流式細胞儀進行 SCSA 法使用相對較多。
5． 3 精子DNA完整性檢測的結果解 讀
目 前 SCSA、FISH 及 SCD 等方法使用相對較多。對于精DNA 完整性檢測的結果上，使用精子 DNA 碎片指數(shù)( sperm DNA fragmentation index，DFI) 高低來 表示，目前一般認為: DFI≤15% 為正常，15% ＜ DFI ＜ 30% 為一般，若 DFI≥30% 認為完整性較差，可能會影響妊娠結局［41-42］。
5． 4 精子 DNA 完整性檢測結果的臨床處理策略
針對高 DFI 患者，建議其改善不良生活習慣，避免接 觸吸煙、酗酒、藥物等生殖毒性物質和桑拿等過高熱 環(huán)境; 服用抗氧化劑，如維生素的補充; 如有感染進行抗感染治療; 針對病因的手術治療，如精索靜脈曲 張結扎術等。 總之，男性生殖遺傳學檢查對于指導臨床診療 有重要意義，生殖遺傳學檢查的指征及處理策略需 要在臨床中進一步規(guī)范及完善，盡管還存在不同學術觀點，但隨著檢測技術飛速發(fā)展及更多臨床研究 的開展，生殖遺傳學檢查在男科領域內的應用將更 為規(guī)范。
編寫組成員名單 顧 問: 姜 輝 鄧春華 組 長: 商學軍 成 員: ( 排名不分先后) 谷翊群 黃 錦 劉德風 陳 亮 史軼超 夏欣一 杜 強 唐文豪 高 勇 崔英霞 洪 鍇 孫 斐 執(zhí) 筆: 陳 亮 夏欣一 劉德風
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( 收稿日期: 2015-11-25; 接受日期: 2015-11-27)(責任編輯：佳學基因)
