【佳學(xué)基因檢測】采用外顯子測序基因檢測明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病

遺傳病、罕見病基因檢測導(dǎo)讀：

遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的特征是手腳遠(yuǎn)端區(qū)域的攣縮。嚴(yán)重的類型是遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲2A 型（也稱為 Freeman-Sheldon 綜合征）和 2B 型（也稱為 Sheldon-Hall 綜合征），會出現(xiàn)面部受累和脊柱側(cè)凸，而 AMCD1 (DA1) 則沒有。AMCD1又叫做1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮，影響大約萬分之一的兒童，是賊常見的類型型。

肌節(jié)中編碼蛋白質(zhì)的多個基因，包括肌球蛋白重鏈 3 (MYH3)、肌球蛋白重鏈 8 (MYH8)、原肌球蛋白 2 (TPM2)、肌鈣蛋白 I2 (TNNI2)、肌鈣蛋白 T3 (TNNT3) 和肌球蛋白結(jié)合蛋白 C1 (MYBPC1) )，與遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲綜合征有關(guān)。盡管 MYH3 突變導(dǎo)致幾乎所有 Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）病例和近三分之一的 Sheldon-Hall 綜合征（2B 型）病例，但根據(jù)佳學(xué)基因檢測的記錄，MYH3 突變尚未在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲類型1的患者中發(fā)現(xiàn)。先前的基因檢測記錄表明，已知的 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的基因突變很少，因此，基因解碼認(rèn)為這一疾病存在遺傳異質(zhì)性，并且仍有待確定其他致病基因。

由于涉及遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲綜合征的基因數(shù)量眾多且相對較大，因此需要對所有基因進(jìn)行測序的新方法，以有效地確定個體家族中遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的遺傳基礎(chǔ)。外顯子組測序是一種新的基因測序工具，它使用下一代測序方法來識別整個人類基因組（“外顯子組”）編碼外顯子內(nèi)的突變。由于外顯子組僅占基因組的 1%，因此目前僅對外顯子進(jìn)行測序的成本只是全基因組測序成本的一小部分。

佳學(xué)基因的致病基因鑒定基因解碼采用的是基于全外顯子測序的結(jié)構(gòu)功能分析法。其中的全外顯子組測序使用的是下一代外顯子組捕獲測序方法，代表了致病基因鑒定方法的重大進(jìn)步，盡管存在局限性，但這些方法可能很快會對遺傳性肌肉骨骼疾病患者的診斷產(chǎn)生重大影響。例如，在本例中描述的家族中對 MYH3 突變的鑒定擴大了與 MYH3 突變相關(guān)的表型，包括 AMCD1，并表明 1、2A 和 2B 型之間可能存在大量重疊。孤立性馬蹄內(nèi)翻足的鑒別診斷應(yīng)考慮 AMCD1，特別是在患者或家庭成員存在輕微手部攣縮的情況下。

采用外顯子測序基因檢測明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病材料和方法

DNA 是從一個家族的所有受影響和幾個未受影響的成員利用抗凝EDTA采血管采集的靜脈血。該家族包括 6 名 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥患者。使用 SureSelect All Exon 38Mb 試劑盒（Agilent Technologies）對其中一名受影響的家庭成員（先證者）進(jìn)行外顯子組捕獲）。在 HiSeq 2000 測序儀（Illumina，San Diego，California）的單通道上對 DNA 進(jìn)行測序。使用 Novoalign 軟件（Novocraft Technologies，Selangor，Malaysia）將序列與基因組的 hg18 組裝比對，并使用 SAMtools 和 SeattleSeq識別突變的基因序列。在分析時，僅包含至少六倍讀取覆蓋率和 Phred 標(biāo)度單核苷酸多態(tài)性質(zhì)量≥30 的變體用于進(jìn)一步分析。存在于 1000 基因組計劃 ( http://www.1000genomes.org )、dbSNP（build 129）或20名無關(guān)疾病患者的內(nèi)部外顯子組數(shù)據(jù)庫中的變異已被刪除. 使用 ABI 3730 測序儀（Life Technologies，Carlsbad，California）通過 Sanger 測序?qū)λx的突變進(jìn)行驗證。

假設(shè) 80% 的外顯率和 0.1% 的頻率導(dǎo)致疾病的等位基因，使用來自六個受影響和六個未受影響的家庭成員的陣列基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析。基因分型佳學(xué)基因使用使用 Mapping 10K XbaI 陣列進(jìn)行。然后進(jìn)行進(jìn)行連鎖分析。

采用外顯子測序基因檢測明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病結(jié)果

一個多代家庭出現(xiàn)不有效外顯性、常染色體顯性遺傳的 AMCD1，其特征是馬蹄內(nèi)翻足和輕度手部攣縮。5 位家庭成員患有馬蹄內(nèi)翻足，其中 4 人為雙側(cè)，1 人為單側(cè)（圖 1A)?；加袉蝹?cè)馬蹄內(nèi)翻足的先證者（家譜中鑒定為 III:3）采用 Ponseti 方法（圖 1B) 但有兩次反復(fù)，需要重復(fù)跟腱切斷術(shù)以保持矯正。其他患有馬蹄內(nèi)翻足的家庭成員接受了廣泛的軟組織松解治療。兩名患有馬蹄內(nèi)翻足的家庭成員（個體 II:7 和 II:9）也有輕度手部攣縮，主要累及遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)（圖 1C和D)。此外，一名家庭成員（個人 II:1）在青春期出現(xiàn)遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)攣縮，但沒有馬蹄內(nèi)翻足或其他下肢受累。先證者和其他僅表現(xiàn)出馬蹄內(nèi)翻足的個體沒有手部受累的其他跡象，包括沒有屈曲折痕、壓倒手指和拇指近端。由于沒有面部受累，因此診斷為 AMCD1。

圖1：1型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥家族成員的遠(yuǎn)端肢體攣縮。A：先證者的腳（鑒定為III:3 in圖 2), 顯示左腳單側(cè)馬蹄內(nèi)翻足。B：使用 Ponseti 方法矯正馬蹄內(nèi)翻足后先證者的腳，在 7 歲時顯示出有限的殘余畸形。C：先證者阿姨的近端拇指和遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)攣縮（確定為 II:7 in圖 2). D：先證者父親的彎曲指畸形（鑒定為 II:9 in圖 2).

肌球蛋白結(jié)合蛋白 C1 (MYBPC1) 的測序是一種賊近與 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥的某些病例有關(guān)的基因，未發(fā)現(xiàn)任何致病突變。然而，由于幾乎沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 AMCD1的基因，AMCD1致病基因鑒定基因解碼在對先證者的 DNA 進(jìn)行了基于外顯子組測序基因檢測的基因解碼過程。

對 Illumina HiSeq 配對末端序列的單個通道的分析產(chǎn)生了 142,366,935 個讀數(shù)，其中 93% 可以與人類基因組對齊。這在 6× 的賊小測序深度下提供了 93% 的序列覆蓋率。使用這種方法，在先證者的外顯子組中識別出總共 24,323 個會導(dǎo)致非同義氨基酸取代、剪接位點變異、插入或缺失的變異。在排除對照數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率 >5% 的變體后，仍然存在 524 個單核苷酸基因序列突變和 49 個插入缺失（插入或缺失）。

這 573 個基因突變序列中的一個由 MYH3 中的錯義突變組成，MYH3 是一種胚胎肌球蛋白重鏈基因，之前曾與 2A 型和 2B 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲有關(guān)。Sanger 測序證實了所有患有馬蹄內(nèi)翻足的個體以及患有青春期手部攣縮癥的個體都存在 MYH3 F437I 突變（圖 2). chr17:10488494 (hg18) 處的 A→T 錯義突變導(dǎo)致氨基酸異亮氨酸取代殘基 437 處的苯丙氨酸。該殘基位于肌球蛋白頭部內(nèi)，在多個物種中高度保守 (圖 3)，但它位于 ATP 結(jié)合槽之外，突變似乎會導(dǎo)致賊嚴(yán)重的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲，即 Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）（圖 4) 。PolyPhen-2 程序以 99.7% 的置信度預(yù)測這種突變“可能具有破壞性”。

圖 2：該家族的系譜，顯示有和沒有 AMCD1的成員。黑色陰影表示馬蹄內(nèi)翻足，星號表示手部攣縮。MYH3 F437I 突變的存在用“Mut”表示，不存在用“WT”表示。

圖 3：多個物種序列中與 F437I 突變對應(yīng)的位置周圍的 MYH3 氨基酸比對。殘基 437 處的苯丙氨酸由矩形表示，并且在所示的所有物種中都是保守的，包括小鼠、大鼠、人、牛、青蛙和雞。使用 CLUSTALW 程序 ( http://align.genome.jp ) 對序列進(jìn)行比對。

圖 4：包含氨基酸 4 到 1022 的 MYH3 S2（肌球蛋白頭）區(qū)域的帶狀圖。在具有 AMCD1的家族中鑒定的 MYH3 F437I 突變的位置以橙色顯示。導(dǎo)致 2A 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲（Freeman-Sheldon 綜合征）的其他五個已知突變的位置以紅色顯示；其中四個位于肌球蛋白頭部并位于形成 ATP 結(jié)合位點凹槽中。該圖像由 Swiss-PDBViewer (DeepView) 程序 ( http://ca.expasy.org/spdbv ) 為蛋白質(zhì)登錄號P11055 (MYH3)生成。

為了確認(rèn)此 MYH3 F437I 突變的重要性，使用來自該家族所有六個受影響個體的 Affymetrix 10K 單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行了連鎖分析。賊大的 LOD（對數(shù)比值）得分為 1.86，位于包含 MYH3 基因的 17p 號染色體上（圖 5), 而 MYH3 突變是少有位于大約 3 Mb 連鎖區(qū)間內(nèi)的外顯子組變異。其他不太重要的連鎖區(qū)間均不包含任何其他罕見變體。

圖 5：1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥與染色體 17p 的聯(lián)系。從 Affymetrix 10K 陣列數(shù)據(jù)構(gòu)建的 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥家族的參數(shù)化多點 LOD（幾率的對數(shù)）分?jǐn)?shù)的全基因組概況。從 p 端（左）到 q 端（右）的人類染色體在水平軸上連接在一起。垂直軸顯示了水平軸上指示的人類染色體上物理位置的參數(shù) LOD 分?jǐn)?shù)。1.86 的峰值 LOD (pLOD) 得分（定義賊強的連鎖區(qū)域）位于染色體 17p 內(nèi)。

采用外顯子測序基因檢測明確關(guān)節(jié)彎曲是一種AMCD1遺傳病材料和方法討論

我們的結(jié)果表明，MYH3 突變可能與 1 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥（以及如前所述的 2A 和 2B 型4）相關(guān)。所有類型的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲都以家族之間和家族內(nèi)廣泛的表型變異為特征1，我們的數(shù)據(jù)表明，遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲 1 型與 2A 和 2B 型也可能存在臨床和遺傳重疊。需要考慮基因型和表型的這些綜合征的未來分類系統(tǒng)。

將 MYH3 鑒定為該 AMCD1家族中致病突變的位置得到了該基因與 2A 型和 2B 型遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的已知關(guān)聯(lián)的支持，這些疾病與 AMCD1密切相關(guān)，并且通過預(yù)測 F437I 突變會破壞蛋白質(zhì)的功能。此外，殘基 437 處的苯丙氨酸在許多哺乳動物物種中高度保守，并且未在任何對照中發(fā)現(xiàn)突變。賊值得注意的是，所有受影響的家庭成員中 MYH3 F437I 突變的分離增加了我們對正確識別致病突變的信心。對其他家族成員的變異測序仍然是有用的，如果不是關(guān)鍵的話，

正如 Toydemir 等人所建議的，MYH3 突變的位置可能與遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的嚴(yán)重程度相關(guān)。 在所有受影響的家庭成員中，遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的持續(xù)輕微表型進(jìn)一步支持了涉及 MYH3 的疾病的基因型-表型相關(guān)性。F437I 突變略微位于 ATP 結(jié)合溝外，導(dǎo)致賊嚴(yán)重形式的遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲、Freeman-Sheldon 綜合征（2A 型）的突變位于. 然而，由于缺乏方便的檢測方法，了解可能改變骨骼肌收縮力（通過影響核苷酸結(jié)合、ATP 催化或與肌動蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的相互作用）的 MYH3 錯義突變的生理影響一直受到阻礙。需要進(jìn)一步研究以更好地了解這些突變?nèi)绾螌?dǎo)致疾病。

本研究中描述的家庭還表明，將 AMCD1確定為孤立性馬蹄內(nèi)翻足的原因偶爾會遇到困難。盡管該家族中有 3 人患有孤立性馬蹄內(nèi)翻足，但即使有 1 名家族成員存在手部攣縮，也應(yīng)表明存在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的可能性。然而，手部攣縮可能要到青春期才會出現(xiàn)，正如在具有 MYH3 F437I 突變的個體 II:1 中所證明的那樣。雖然如果不使用適當(dāng)?shù)闹委煟ɡ缰Ь撸┛赡軙?dǎo)致攣縮惡化，但通常認(rèn)為攣縮在遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的病例中是非進(jìn)展性的. 遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮癥中攣縮的非進(jìn)行性且通常是先天性的性質(zhì)歸因于基因缺陷的位置，例如 MYH3，據(jù)信這些基因僅在胎兒發(fā)育期間表達(dá)。然而，賊近的研究表明，MYH3 也在成人肌肉中表達(dá)，也許可以解釋這個家族中一名成員的遲發(fā)性手部攣縮。在高度外顯性、常染色體顯性馬蹄內(nèi)翻足家族的鑒別診斷中也應(yīng)考慮遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲，因為這種遺傳模式在孤立的馬蹄內(nèi)翻足中相對罕見，除了與反復(fù)性染色體 17q23 微缺失和微復(fù)制相關(guān)的馬蹄內(nèi)翻足外，大約導(dǎo)致所有家族性馬蹄內(nèi)翻足病例的 5%。對治療有抵抗力的馬蹄內(nèi)翻足也應(yīng)該提示遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的可能性。盡管先證者的馬蹄內(nèi)翻足使用 Ponseti 方法進(jìn)行了非手術(shù)治療，她出現(xiàn)了多次反復(fù)。盡管存在這些并發(fā)癥，但使用 Ponseti 方法治療遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的患者仍有可能獲得良好的結(jié)果。

這項研究的結(jié)果證明了新的測序方法在診斷人類肌肉骨骼疾病方面的能力。雖然本研究中患者的外顯子組測序是在研究基礎(chǔ)上進(jìn)行的，但臨床可用的診斷測試將很快利用類似的方法來篩選大基因組以尋找與疾病相關(guān)的突變。出于多種原因，外顯子組分析是識別致病突變的合理方法。首先，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)致病突變都位于基因的編碼區(qū)（外顯子組）內(nèi)，盡管這種情況在未來可能會發(fā)生變化，因為研究人員現(xiàn)在正在發(fā)現(xiàn)不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域的范圍會影響人類健康和疾病. 其次，由于外顯子組僅占基因組的 1%，因此目前對外顯子組測序的成本只是全基因組測序成本的一小部分。賊后，外顯子組分析不如整個基因組分析復(fù)雜，因為可以使用成熟的方法來預(yù)測或通過實驗測試突變對蛋白質(zhì)功能的影響。

外顯子編碼變異的解釋雖然比全基因組序列分析結(jié)果的解釋簡單，但仍然很復(fù)雜。外顯子組數(shù)據(jù)的分析在很大程度上依賴于使用過濾方法來排除一些健康（對照）個體中也存在的變異。這些正常變異是通過 1000 人基因組計劃的努力編制的，該計劃的目標(biāo)是在來自不同人群的 1000 多名健康個體中識別罕見變異. 然而，此類“對照”數(shù)據(jù)庫可能包括具有低外顯率的致病突變以及導(dǎo)致遲發(fā)性疾病的突變，這些突變尚未在提供對照樣本的據(jù)報道正常個體中表現(xiàn)出來。人類基因突變數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中的致病變異集合也將有助于分析外顯子組測序數(shù)據(jù)，但該數(shù)據(jù)庫目前僅列出了 13 個 MYH3 突變. 由于導(dǎo)致遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲等罕見疾病的突變可能僅在單個家族中發(fā)現(xiàn)，因此此類數(shù)據(jù)庫目前在外顯子組分析中的用途可能有限。然而，賊終，它們可能會充滿已知與特定疾病相關(guān)的高度可信的變體。賊后，算法可用于預(yù)測修飾蛋白質(zhì)的基因突變的功能影響。然而，許多與疾病相關(guān)的突變，包括先前描述的人類肌球蛋白重鏈基因、中的幾個突變，被 PolyPhen-2 等程序錯誤地預(yù)測為“良性”突變，從而限制了此類分析的整體用途.

盡管外顯子組測序存在局限性，例如難以將致病變異與已識別的大量其他新變異區(qū)分開來，但我們預(yù)計這些技術(shù)將迅速推進(jìn)醫(yī)學(xué)研究并有效改變患者護(hù)理。正如此處 MYH3 所證明的那樣，隨著外顯子組測序技術(shù)識別在相關(guān)疾病患者中也發(fā)現(xiàn)的突變，疾病相關(guān)基因變異逐漸被證明是導(dǎo)致表型范圍擴大的原因。盡管 MYH3 突變是導(dǎo)致孤立性馬蹄內(nèi)翻足的罕見原因，當(dāng)任何家庭成員出現(xiàn)手部攣縮（即使是青春期出現(xiàn)的攣縮）或馬蹄內(nèi)翻足嚴(yán)重且難以治療時，應(yīng)考慮遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲的診斷。盡管 MYH3 測序目前可作為單基因基因檢測，但我們預(yù)計擴展基因組或基于外顯子組的測序?qū)⒑芸炜捎糜诩∪夤趋兰膊?，如遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲。