【佳學基因檢測】這個家族的阿爾澤默氏病和老年癡呆的基因找到了！

病例介紹：

佳學基因的老年癡呆基因解碼，記錄了對一個大家族進行基因分析的病例 。該家庭中具有疑似晚發(fā)型阿爾茨海默病的疾病表征。從2008 年，患者到致病基因鑒定基因解碼合作醫(yī)院和診所進行就醫(yī)。基因解碼合作醫(yī)師在詢問患者的家族史時，發(fā)現(xiàn)該患者具有阿爾茨海默病家族史，因此建議對家族中所有在世成員進行了徹底檢查。該家族中的患者符合美國國家老齡化和阿爾茨海默病協(xié)會 (NIA-AA) 設(shè)定的可能診斷為阿爾茨海默病的標準。阿爾澤默氏病和老年癡呆基因檢測依據(jù)《赫爾辛基宣言》要求，所有受檢者均簽署了書面知情同意書。檢測結(jié)果通過倫理委員會。

阿爾茨海默病的基因解碼過程

依據(jù)普通的基因檢測流程，首先使用 QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德國曼海姆）在臨床診醫(yī)學檢驗實驗室，對從受檢者身上獲取血液提取基因組 DNA。為了最大程度降低不必要的花費，通過 Sanger 測序篩查先證者 APP、PSEN1 和 PSEN2 中的致病突變。通過短熒光片段的定量多重 PCR 致病基因鑒定基因解碼 APP 重復。所得的基因檢測結(jié)果為陰性。然后，臨床基因組學中心采用Illumina NeuroX 陣列對先證者進行了基因分型。該陣列包括 Exome Be阿爾茨海默病Chip，它評估與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的已知致病變異，由大約 24,000 個變異組成。檢測結(jié)果仍然為陰性。

隨后，受檢者選擇了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病基因鑒定基因解碼。在這一分析檢測中，對三名受影響的個體（SF22、SF6 和 SF21；圖 1A）和兩名健康親屬（SF11 和 SF27；圖 1A）進行了外顯子組測序 (ES)。使用致病基因鑒定基因解碼外顯子組試劑盒 V4 (59M, 100x) 對基因組 DNA 進行靶向富集。然后將捕獲的文庫加載到 BGISEQ-500 平臺上。對 100 bp 的雙端讀取長度進行 200 次循環(huán)測序。ES 數(shù)據(jù)的生物信息學分析遵循成熟的 GATK 最佳實踐，用于識別單核苷酸變異和小插入和缺失。簡而言之，將讀取與使用 BWA-MEM構(gòu)建的 hg19 參考構(gòu)建體對齊，然后使用 PicardTools (http://picartools.sourceforge.net) 刪除重復項，并使用 GATK重新校準堿基質(zhì)量分數(shù)。使用 SAMtools和 GATK 收集比對和覆蓋率統(tǒng)計數(shù)據(jù)。阿爾茨海默病致病基因鑒定基因解碼分析組使用 HaplotypeCaller 生成 gVCF，并將其與內(nèi)部 gVCF 集合相結(jié)合，使用 GATK GenotypeGVCF 進行聯(lián)合基因分型。然后使用 GATK VariantRecalibrator 和 ApplyVQSR 重新校準調(diào)用的變體。使用 VEP對最終 VCF 進行注釋。使用 ABI 3130XL 和 ABI BigDye Terminator 測序試劑盒 V 3.1（Life Technologies）通過 Sanger 測序進行序列驗證和分離分析。使用 SeqScape v2.6 軟件（Life Technologies）檢查序列。

圖1：簡化的阿爾茨海默病家族的家族譜。GRIN2C p.(A1072V) 與阿爾茨海默病共同分離。為了尊重參與者的隱私，一些人的性別被掩蓋，譜系被打亂。箭頭表示先證者 (II7) 和接受致病基因鑒定基因解碼的受試者 (II6、II9、III2、III11、IV7)。黑色菱形表示被診斷患有阿爾茨海默病的個體，譜系顯示具有阿爾茨海默氏病表型的家族成員，其中 GRIN2C 基因中的錯義變異分離。B Sanger 測序色譜圖顯示 GRIN2C 基因中的野生型序列和雜合 c.3215C > T 雜合變異。 C 基因解碼揭示GRIN2C 氨基酸變化的變異耐受性。Ala1072Val 變化被認為是“不耐受的”，表明具有致病作用。

為了找到可能從最近的共同祖先那里遺傳下來的血統(tǒng)認同 (IBD) 片段，基因解碼使用了 Beagle v4.1分析工具。最初，從內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中選擇了與致病基因鑒定基因解碼家庭具有相同祖先背景的個體的外顯子組。這包括 15 名無關(guān)個體，以及 SF6、SF21、SF22、SF11 和 SF27 個體。樣本是從帶注釋的多樣本 VCF 文件中獲取的。佳學基因使用了過濾器以僅保留雙等位基因“PASS”變體，這些變體由該隊列中的至少兩個個體共享，并在 90% 以上的樣本中進行基因分型。修剪后，致病基因鑒定基因解碼獲得了每 5 Mb 500 個標記的平均速率。根據(jù)文檔中的建議，基因解碼使用 500 的窗口大小運行 Beagle。此外，修改了以下參數(shù)的默認設(shè)置：“ibd = True”、“ibdtrim = 15”、“overlap = 160”和“niterations = 10.000”。

然后使用 Merlin v.1.1.2來獲取該家族中罕見等位基因與癡呆癥疾病表型之間共同分離（連鎖）的概率。根據(jù)常染色體顯性遺傳對雜合和純合基因型的外顯率為 0.90 建立了中度罕見性狀（患病率：1%）的模型，并進行了單點參數(shù)連鎖分析以計算相應(yīng)的 LOD 分數(shù)。然后，佳學基因遺傳學分析使用 R v.3.5.1 將 LOD 得分轉(zhuǎn)換為 p 值，公式為：pchisq(x*(2*log(10)),df=1,lower.tail=FALSE)/2。

候選基因的選擇和基因型的驗證

處理 DNA 樣本以生成序列讀數(shù)，并使用生物信息學分析流程來識別單核苷酸變異或小插入和缺失。 按照此生物信息學流程，使用內(nèi)部腳本對生成的多樣本 VCF 進行后處理，該腳本允許僅保留在三個受影響個體（SF22、SF6 和 SF21）之間分離的雜合和純合變異，這些變異分別對應(yīng)于兩個健康親屬（SF11 和 SF27）中的野生型或攜帶者狀態(tài)。下游分析中僅保留了經(jīng)過以下過濾步驟后仍存在的變體：

1) 預(yù)測會對蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生影響的“PASS”變體（錯義、移碼、無義和剪接變體）；

2) gnom阿爾茨海默病 v2.1.1 中最大等位基因頻率 ≤ 0.001 的稀有變體；

3) 在多樣本 VCF 中等位基因頻率 < = 0.02 的變體，因為基因解碼根據(jù)大量的病例分析發(fā)現(xiàn)此閾值可以排除可能的測序偽影或隊列特異性多態(tài)性，而不會影響家族中的真實候選變體；

4) 具有組合注釋依賴性耗竭 (C阿爾茨海默病D)  phred 分數(shù) > = 15 的變體；

5) IBD 片段內(nèi)基因中的變體。

然后使用 Phenolyzer對所有默認參數(shù)進行排序，根據(jù)其與阿爾茨海默病表型的相關(guān)性對其余相應(yīng)基因進行優(yōu)先排序，從而識別出特定的目標變異。佳學基因致病基因鑒定分析團隊還使用功能基因組學工具 Met阿爾茨海默病ome 來識別致病變異不太可能被容忍的關(guān)鍵蛋白質(zhì)區(qū)域。

最后，為了驗證結(jié)果，對 15 名目標家庭成員進行了桑格測序。其中包括 6 名癡呆癥患者和 9 名健康人。

臨床病征的深度分析

致病基因鑒定基因解碼分析的這個病例是一個四代大家族譜系，提示該家族阿爾茨海默病的遺傳模式為常染色體顯性遺傳（圖 1A）?；颊呤且幻?80 歲的右撇子女性，受教育年限為 5 年，2008 年入住與佳學基因具有病例交流合的神經(jīng)科學和精神健康系記憶診所。她表現(xiàn)出輕度認知障礙，包括短期記憶缺陷、空間時間定向障礙和冷漠，從 78 歲開始。她部分能夠完成家務(wù)，財務(wù)管理能力中度受損。72 歲時，她被診斷出患有重度抑郁癥，并接受選擇性血清素再攝取抑制劑治療。據(jù)報道，她有明顯的癡呆癥家族史。神經(jīng)心理學評估顯示患者有中度遺忘性認知障礙，簡易精神狀態(tài)檢查 (MMSE) 評分為 19 分（滿分 30 分）。神經(jīng)系統(tǒng)檢查未發(fā)現(xiàn)任何異常，例如肌陣攣、小腦體征、痙攣性截癱或錐體外系體征。腦部 MRI 顯示雙側(cè)額葉和頂葉萎縮。單光子發(fā)射計算機斷層掃描 (SPECT) 掃描顯示頂葉后部灌注輕度對稱性減少，符合 2008 年的阿爾茨海默病。腰椎穿刺顯示 Aβ42 值降低，磷酸化 tau-181 水平升高。隨后，根據(jù)臨床評估的標準診斷為阿爾茨海默病。事后，還根據(jù)陽性生物標志物診斷為阿爾茨海默病。先證者攜帶 APOE ε3ε3 基因型。兩位兄弟姐妹在 70 多歲時在佳學基因的記憶診所被診斷出患有晚發(fā)性阿爾茨海默病，其中一位姐妹還接受了腦脊液腰椎穿刺，證實了阿爾茨海默病的診斷。此外，家族中的其他五名成員也被臨床診斷為晚發(fā)性阿爾茨海默病。八位兄弟姐妹直到去世都沒有患上癡呆癥。

家族篩選及驗證為阻斷遺傳提供充足信息

2009 年，盡管已診斷為阿爾茨海默病，三名阿爾茨海默病患者中在其他機構(gòu)進行的基因檢測未發(fā)現(xiàn) APP、PSEN1 和 PSEN2 基因的致病變異，這一結(jié)果在致病基因鑒定基因解碼中得到驗證。此外，NeuroX 陣列分析、全基因芯片基因檢測排除了與 77 種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)基因相關(guān)的已知變異，即檢測結(jié)果也為陰性。隨后，五名受試者選擇了基于全外顯子組測序的致病基因鑒定基因解碼基因檢測，其中包括三名患有阿爾茨海默病的患者和兩名健康受試者。致病基因鑒定基因解碼從聯(lián)合基因分型、多樣本 VCF 開始，獲得了 1199 個變異（分別為 766 個雜合子和 433 個純合子。隨后，經(jīng)過每個過濾步驟后，阿爾茨海默病獲得：

663 個“PASS”變異（435 個雜合子和 228 個純合子）；

gnom阿爾茨海默病 v2.1.1 和內(nèi)部隊列中有 22 個雜合罕見變異）；

16 個雜合變異，C阿爾茨海默病D phred 得分 > = 15。

最后，8 個經(jīng)過篩選的變異位于 IBD 節(jié)段內(nèi)。

雖然所有相應(yīng)基因均未與阿爾茨海默病病理生物學有明確的關(guān)系，但 GRIN2C 在 Phenolyzer 網(wǎng)站上的 Phenolyzer 分析中獲得了相對最高的分數(shù)（0.086），針對疾病術(shù)語“阿爾茨海默病家族性”和“阿爾茨海默病晚發(fā)性”。 GRIN2C 變體位于 17:74,842,922 染色體上，涉及編碼序列外顯子 13 中的 C > T 變化（NM_000835.6:c.3215C > T），導致蛋白質(zhì)位置 1072 處的丙氨酸被纈氨酸取代（p.Ala1072Val）（圖 1B）。根據(jù) C阿爾茨海默病D phred 評分，p.Ala1072Val 變體可能會影響蛋白質(zhì)功能，并且根據(jù)最新 gnom阿爾茨海默病 版本（v.4.0），在一般人群中等位基因頻率極低，為 2.64e-05。此 gnom阿爾茨海默病 v.4.0 頻率對應(yīng)于 15 個等位基因的絕對總數(shù)，全部處于雜合狀態(tài)（13/15）。盡管該變異位置目前在 gnom阿爾茨海默病 v.4.0 外顯子組中存在測序覆蓋警告（僅占 gnom阿爾茨海默病 個體的 20%），但等位基因頻率在 gnom阿爾茨海默病 版本和 gnom阿爾茨海默病 v.4.0 基因組（2.63e-05，https://gnom阿爾茨海默病.bro阿爾茨海默病institute.org/variant/17–74842922-G-A?dataset=gnom阿爾茨海默病_r4）中高度一致。該頻率可能與 gnom阿爾茨海默病 等未經(jīng)選擇的參考人群中存在晚發(fā)型疾病風險的個體相符。不幸的是，gnoma阿爾茨海默病 v.4.0 中只有 3/15 個體的年齡信息可用，且所有個體年齡均小于 70 歲。LOD 得分為 2.070（p = 0.001），強烈支持這種罕見等位基因與該家族癡呆表型之間的關(guān)聯(lián)。這一證據(jù)與在 17 號染色體上檢測到的廣泛 IBD 相一致，8 個候選稀有變體中有 5 個位于該染色體上。

該基因編碼 GRIN2C（或 GluN2C），這是一種約 134 kDa 的 1,233 個氨基酸蛋白質(zhì)。GluN2C 是形成 NMDA 受體異四聚體結(jié)構(gòu)的亞基之一。p.(Ala1072Val) 位于蛋白質(zhì)的細胞質(zhì)域中（圖 1C）。為了驗證基因解碼的結(jié)果，在 15 個家庭成員中對 p.A1072V 進行了桑格測序。發(fā)現(xiàn)它在家族中患有阿爾茨海默病的患者中分離，但在沒有表現(xiàn)出任何認知障礙的家庭成員中沒有分離（圖 1A）。APOE 基因分型發(fā)現(xiàn)，先證者攜帶 APOE ε3ε3 基因型，兩名患病親屬（III5 和 III12）也攜帶 ε3ε3 基因型。利用外顯子組測序數(shù)據(jù)，結(jié)合 rs429358（T > C）和 rs7412（C > T），對另外兩名患病親屬（II7、III11）分別重建了 ε2ε4 基因型和 ε3ε4 基因型的 APOE 基因型。

佳學基因這一病例對健康、治療和遺傳阻斷的影響

據(jù)《影響老年及退體生活質(zhì)量的基因因素》，這項致病基因鑒定基因解碼在晚發(fā)性阿爾茨海默病中發(fā)現(xiàn)了一種具有功能影響的GRIN2C錯義變異，該變異對NMDAR誘導的電流以及與14-3-3支架蛋白的相互作用產(chǎn)生了影響。

晚發(fā)性阿爾茨海默病具有顯著的遺傳成分，佳學基因?qū)ζ溥z傳力進行的估計表明，遺傳因素占該疾病的60%至80%。之前的全基因組關(guān)聯(lián)致病基因鑒定基因解碼（GWAS）已經(jīng)確定了50多個與晚發(fā)性阿爾茨海默病相關(guān)的遺傳位點，主要是在歐洲血統(tǒng)的個體中。然而，這些致病基因鑒定基因解碼大多識別的是常見變異，據(jù)信迄今為止僅解釋了阿爾茨海默病遺傳力的大約一半。為了解決這一局限性，致病基因鑒定基因解碼人員現(xiàn)在正在采用下一代測序策略，如外顯子測序和基因組測序，以識別與阿爾茨海默病相關(guān)的罕見變異。最近的一項外顯子測序致病基因鑒定基因解碼發(fā)現(xiàn)了與阿爾茨海默病風險相關(guān)的ATP8B4和ABCA1基因中的罕見潛在有害變異。這項致病基因鑒定基因解碼強調(diào)了超越常見變異、探索罕見變異以全面理解該疾病遺傳基礎(chǔ)的重要性。與這些努力一致，本案例的致病基因鑒定基因解碼為支持罕見變異在阿爾茨海默病中作用的不斷增長的證據(jù)添加了一個新基因。

查閱《人體結(jié)構(gòu)與功能的基因基礎(chǔ)》，GRIN2C編碼谷氨酸離子型N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）2C亞基（也稱為GluN2C），NMDA受體（NMDARs）的亞基以其在調(diào)節(jié)突觸可塑性以及影響學習和記憶相關(guān)過程中的獨特作用而聞名?；蚪獯a有多項致病基因鑒定基因解碼支持神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸及其受體在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的作用。值得注意的是，含有GluN2C亞基的NMDA受體表現(xiàn)出獨特的生物物理特征和表達模式。小鼠前額葉皮層中GluN2C亞基的耗竭導致興奮和抑制之間的平衡向抑制傾斜。此外，GluN2C的缺失激活了支持神經(jīng)元存活的細胞內(nèi)信號通路，如核cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白水平的升高所示。

在這里，佳學基因證明了過表達突變形式GluN2CA1072V的海馬神經(jīng)元中NMDAR誘導的電流增加，表明該突變可能增強NMDAR功能。有趣的是，最近的一項致病基因鑒定基因解碼顯示，在美金剛的影響下，GluN2C亞基的表達減少，美金剛還誘導前額葉皮層中GRIN2C mRNA水平的改變。作者還報告了GluN2C亞基表達水平的變化，導致皮質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)興奮性的顯著降低，盡管與含有GluN2A和GluN2B的受體相比，含有GluN2C亞基的受體在大腦中明顯較少。

在佳學基因的致病基因鑒定基因解碼中，當佳學基因檢查GluN2C突變形式的表面保留時，發(fā)現(xiàn)它比野生型形式更豐富，這一發(fā)現(xiàn)進一步支持了該變異改變GluN2C功能的觀點，這是基因解碼基因檢測與數(shù)所庫比對基因檢測的根本區(qū)別，從而賦予其更高的檢出率和準確率。

基因解碼表明，谷氨酸是突觸系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，約占所有突觸的40%。改變的谷氨酸能神經(jīng)傳遞可能是一個共同因素，為解釋不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病中觀察到的神經(jīng)認知障礙和癥狀特征提供了統(tǒng)一的視角。阿爾茨海默病的病理標志，如β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和Tau過度磷酸化，與谷氨酸能傳遞之間的關(guān)系主要在體外進行了致病基因鑒定基因解碼。多項報告顯示，Aβ寡聚體和NMDARs在阿爾茨海默病中導致突觸功能障礙和破壞。Aβ對突觸的影響是改變谷氨酸能突觸傳遞并減少海馬神經(jīng)元中谷氨酸和其他突觸成分的表面受體數(shù)量。Ca2+穩(wěn)態(tài)的喪失被認為與阿爾茨海默病中觀察到的早期認知缺陷有關(guān)。此外，Tau作為神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要組成部分，在調(diào)節(jié)突觸功能中起著關(guān)鍵作用。阿爾茨海默病樹突中過量的Tau控制NMDA受體活性，導致樹突中鈣水平升高，可能達到有害水平。這種鈣驅(qū)動的興奮性毒性可能損害突觸后部位并導致神經(jīng)元死亡。這些致病基因鑒定基因解碼表明，NMDA受體的失調(diào)可能導致興奮性毒性，而當前的致病基因鑒定基因解碼通過識別GRIN2C基因中的變異擴展了這一知識，表明其他NMDA受體亞基也可能在阿爾茨海默病發(fā)病機制中發(fā)揮作用。有趣的是，最近一項關(guān)于阿爾茨海默病多變量GWAS的致病基因鑒定基因解碼調(diào)查了遺傳變異對CSF生物標志物譜的作用，顯示與GRIN2D變異和突觸功能成分的全基因組顯著基因關(guān)聯(lián)，進一步支持了突觸功能改變在阿爾茨海默病中的作用。

此外，佳學基因還發(fā)現(xiàn)，與GluN2CWT相比，GluN2CA1072V在細胞表面的定位增加，這一事件與其已知伙伴14-3-3的共定位減少有關(guān)?？傮w而言，這些結(jié)果表明，14-3-3依賴性運輸在神經(jīng)元膜上的生理機制發(fā)生了改變，導致NMDA受體亞基在細胞表面的異常積累。一個合理的解釋是，一旦插入膜中，GluN2C迅速從14-3-3解離（主要作為貨物而不是支架蛋白），從而解釋了觀察到的兩種蛋白質(zhì)之間共定位減少的現(xiàn)象。哺乳動物14-3-3家族由七個進化上保守的蛋白質(zhì)組成，它們結(jié)合多個蛋白質(zhì)靶標，從而影響細胞信號通路。14-3-3蛋白在腦脊液中的存在是幾種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ò搜攀喜　柎暮Ｄ?、腦癌和中風）相關(guān)神經(jīng)元損傷的敏感和特異性生物標志物。在佳學基因的致病基因鑒定基因解碼中，佳學基因發(fā)現(xiàn)GluN2CA1072V對GluN2C與已知伙伴14-3-3的共定位有負面影響，表明與這些支架蛋白的相互作用減少。因此，該變異的致病效應(yīng)可能與這種改變的蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)。另一項最近的致病基因鑒定基因解碼比較了從阿爾茨海默病患者和對照組海馬中分離的聚集蛋白的交聯(lián)，作者發(fā)現(xiàn)共有85種相互作用蛋白僅在阿爾茨海默病患者的組織中與14-3-3特異性相關(guān)。14-3-3蛋白作為分子伴侶，幫助防止細胞應(yīng)激期間蛋白質(zhì)的展開和聚集。因此，GluN2C與14-3-3之間的結(jié)合受損可能與這些患者的神經(jīng)退行性過程有關(guān)。

總之，這項致病基因鑒定基因解碼提出了一個家庭中晚發(fā)性阿爾茨海默病與GRIN2C基因中p.(Ala1072Val)變異相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。此外，這項致病基因鑒定基因解碼提供了有趣的數(shù)據(jù)，支持含有GluN2C的NMDARs和14-3-3蛋白在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的參與。