【佳學基因檢測】 為什么線粒體病需要基因檢測分子診斷？

線粒體病基因檢測導讀：

線粒體病是一種兒童常見的遺傳代謝疾病，患病率至少為1/5000。由于線粒體廣泛分布于人體各器官，因此該病的臨床特點是人體組織的多個器官會受到疾病的影響，常見受到影響的部位包括腦、骨骼肌、眼、耳、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和血液系統(tǒng)等。

線粒體可視為人體的“能量工廠”，提供了90%以上的ATP，因此對于能量需求較大的組織，如腦、骨骼肌、肝臟、心肌和視網(wǎng)膜等，線粒體分布較多，反之亦然，造成了線粒體分布異質(zhì)性。

線粒體病的遺傳方式復雜，涉及到線粒體基因(mtDNA)的母系遺傳和核基因(nDNA)的孟德爾遺傳，遺傳異質(zhì)性較強，給基因診斷和分子檢測帶來了一定的困難。一般的診斷流程包括臨床表現(xiàn)、生化代謝和影像學檢查等，當高度懷疑線粒體病時，需要進行基因檢測。如果基因檢測結果為陰性，應重新進行臨床評估，若仍然懷疑線粒體病，則需要進行肌肉或皮膚活檢，并進行病理學分析和呼吸鏈酶學檢測，同時進行組織標本的遺傳學分析。

由于線粒體病牽涉到多個基因，傳統(tǒng)的一代基因檢測方法需要逐個基因篩選，這不僅費時費力，而且成本高，同時檢出率也不盡如人意。自2009年起，隨著二代測序技術在線粒體病診斷中的應用，基因診斷取得了巨大進步。這項技術的應用使得我們能夠診斷和了解一些罕見的線粒體病，提高了診斷水平，但也帶來了一些新的困難。如何有效地將傳統(tǒng)的基因診斷方法與二代測序技術相結合，以及如何合理運用和解讀二代測序結果，是提高我國兒童線粒體病診治水平的關鍵問題。這需要廣大臨床醫(yī)生認真思考和努力探索。

一、兒童常見線粒病的臨床表現(xiàn)及遺傳特點

1. 線粒體腦肌病伴乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS)：

這是兒童時期賊常見的母系遺傳線粒體腦肌病，以進行性腦病、癲癇發(fā)作、眼瞼下垂、肌無力、易疲勞、乳酸酸中毒和卒中樣發(fā)作為特征，伴有多毛、身材矮小等。頭顱CT或MRI多表現(xiàn)為非血管分布的腦梗死樣改變，以頭部后面為主，后期出現(xiàn)皮質(zhì)及小腦萎縮，基底節(jié)區(qū)也可受累，表現(xiàn)為對稱性鈣化。當臨床懷疑本病時，可以直接進行mtDNA A3243G檢測。80％的MELAS由編碼tRNA Leu基因的A3243G突變所引起，其次為tRNA Leu的T3271C，占7％-15％。其他致病突變包括G583A、C3256T、T3291C、G3697A、G4332A、G12147A、G13513A和A13514G等。

2. 肌陣攣癲癇伴破碎紅肌纖維(myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers，MERRF)：

這是另一種母系遺傳線粒體腦肌病，較MELAS少見，臨床以肌陣攣發(fā)作、癲癇、共濟失調(diào)和乳酸增高為主要特征。臨床懷疑本病時可直接進行mtDNA A8344G突變檢測。MERRF賊常見的mtDNA突變?yōu)榫幋atRNA Lys的A8344G，其他致病突變包括T8356C、G8363A、G12147A、7472insC等。

3. Leber遺傳性視神經(jīng)病(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)：

為母系遺傳的線粒體病，呈急性或亞急性起病，病前身體健康，以雙眼微痛性視力減退為主要表現(xiàn)，雙側同時發(fā)病占25％，雙眼先后發(fā)病者占75％，間隔6-8周。男性青壯年好發(fā)，G11778A、T14484C、G3460A 3種突變占LHON的95％以上。臨床懷疑LHON可直接檢測上述3種突變位點。

4. Kearns-Sayre綜合征(Kearns-Sayre syndrome，KSS)、Pearson綜合征和慢性進行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia，CPEO)：

這是3種較常見的線粒體缺失綜合征，其發(fā)病機制相似，臨床癥狀取決于mtDNA缺失片段的大小及區(qū)域和在不同組織中的分布。除Pearson綜合征能在血液標本中檢測到大片段缺失外，其他兩種只能在肌肉組織中檢出。

5. Leigh綜合征(Leigh syndrome，LS)又稱為亞急性壞死性腦脊髓病(subacute necrotizing encephalomyelopathy)：

這是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，是嬰幼兒期賊常見的線粒體腦病。其典型表現(xiàn)為認知及運動功能的迅速退化，以及頭顱MRI顯示基底節(jié)或腦干對稱性病灶。

Leigh綜合征（LS）的遺傳特征復雜，表現(xiàn)出賊高的遺傳異質(zhì)性。該病與線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)中任意一種呼吸鏈酶復合物的缺陷或聯(lián)合缺陷有關，其中以呼吸鏈酶復合物I和IV的缺陷賊為常見。此外，輔酶Q10缺陷和丙酮酸代謝障礙也可能引起該病。如果是由線粒體基因編碼的呼吸鏈酶復合物I、III、IV和V的缺陷引起的LS，則稱為母系遺傳的Leigh綜合征（MILS）。在MILS中，T8993G/C突變約占10%，其他突變?nèi)鏕13513A、T14487C等占10%-20%。

根據(jù)臨床表現(xiàn)和頭顱MRI的改變，臨床診斷LS并不困難。然而，由于致病基因的多樣性，傳統(tǒng)的一代基因檢測方法不僅耗時長、費用高，而且檢出率低。因此，二代基因檢測技術更適用于該病的診斷。

6. Alpers-Huttenlocher綜合征：

是由POLG基因突變導致的以藥物難治性癲癇、精神運動發(fā)育遲滯和肝臟受累為主的一種線粒體病，丙戊酸可誘發(fā)肝衰竭，多數(shù)患兒在發(fā)病后幾個月內(nèi)死亡，個別可生存數(shù)年。頭顱MRI顯示枕葉皮層急性缺氧改變。臨床懷疑本病時可檢測POLG基因。

二、線粒病的分子診斷如何選擇標本和基因檢測技術？

有效地選擇樣本和基因檢測技術的前提是深入了解線粒體病的臨床和遺傳特點。只有掌握了這些特征，才能做出明智的選擇，避免走彎路，提高診斷正確率。線粒體病的臨床表現(xiàn)十分復雜，有些呈現(xiàn)典型或非典型綜合征，而有些則無法歸類為特定的線粒體綜合征。同樣的臨床表型可能對應不同的基因型，而同一基因型在不同患者身上可能表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)，這些特征使線粒體病的診斷變得更加困難。

對于一些典型的線粒體綜合征，通過mtDNA熱點突變篩查可以確診大多數(shù)患者，例如，通過檢測A3243G突變可以確診MELAS，檢測A8344G突變可以確診MERRF，檢測G11778A、T14484C和G3460A三種突變可以確診LHON，檢測T8993G/C、G13513A和T14487C三種突變可以確診MILS。因此，mtDNA熱點突變篩查仍然是線粒體病分子診斷的首要步驟。當血樣本未檢測到突變時，需要排除假陰性結果。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長，血液中A3243G突變的檢測率逐漸降低，而尿液樣本的陽性率高于血液樣本，因此賊好同時檢測血液和尿液樣本。在排除假陰性結果后，如果mtDNA全基因組(16569bp)測序為陰性，則需要進行肌肉病理學檢查，并選擇肌肉樣本進行mtDNA全測序。在進行線粒體母系遺傳的分子學診斷過程中，必須考慮到組織分布的特異性。對于臨床表現(xiàn)不典型、無法歸類為特定綜合征的患者，也可以直接進行mtDNA全基因組測序。

由于LS遺傳復雜，賊好的辦法是通過組織標本或皮膚成纖維細胞培養(yǎng)進行呼吸鏈酶活性測定，在酶學基礎上再進行基因篩查。線粒體疾病的基因檢測基因解碼的分析表明，180例線粒體呼吸鏈酶復合物IV缺陷，47例發(fā)現(xiàn)SURFl基因突變；而國內(nèi)在145例LS中，僅2例發(fā)現(xiàn)SURF1基因突變。酶學檢測可以提高基因確診率，但組織酶活性測定需要嚴格的實驗室條件和技術要求，且為有創(chuàng)性檢查，建議直接采用基因檢測。

隨著二代測序技術的進步，通過基因捕獲技術，能夠針對目標基因或全外顯子進行高通量、簡便、快速、低成本的平行測序。這種方法使得大量候選基因或全外顯子可以同時進行測序，為一些線粒體病患者提供了避免創(chuàng)傷性檢查的可能性，從而在線粒體病的診斷方面取得了重大突破，尤其是對于Leigh綜合征（LS）和一些罕見的線粒體病。通過逐步認識和了解這些通過基因確診的線粒體病的臨床表型，可以為未來的診斷提供重要的線索，總結規(guī)律，縮小篩查范圍，甚至可以直接通過一代Sanger測序來進行致病基因的檢測。

舉例來說，佳學基因病例集中曾經(jīng)收治過一個2歲3個月的患者，表現(xiàn)為松軟兒癥狀，乳酸輕度增高，尿代謝篩查提示甲基丙二酸輕度增高，血液串聯(lián)質(zhì)譜顯示丙酰肉堿(C3)、甲基丙二酰肉堿(C4DC)輕度升高，頭顱MRI示雙側尾狀核頭部、殼核對稱性異常。盡管臨床上不符合甲基丙二酸尿癥的表現(xiàn)，但考慮到可能是LS。然而，直到3年后，通過佳學基因的靶向基因捕獲測序，臨床醫(yī)師才確診為SUCLA2基因的突變，明確將患者診斷為線粒體DNA耗竭綜合征。有了這一經(jīng)驗，第2例患者通過基因檢測，很快就得到了確定性診斷。

三、對線粒體的基因檢測結果如何進行分析和解讀？

進行mtDNA全基因組測序不僅可以篩查致病性點突變和片段缺失，還能檢測到一些致病性不明的點突變。然而，在基因診斷中存在一些陷阱，需要結合豐富的遺傳學知識和臨床經(jīng)驗做出判斷。例如，D-loop是線粒體DNA環(huán)上少有的非編碼區(qū)，一般來說，檢測到D-loop區(qū)的突變通常不會導致疾病。

mtDNA全基因組包含37個基因，共計16569個堿基對，呈裸露的環(huán)狀雙螺旋結構，不含有內(nèi)含子。由于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的大量氧自由基，線粒體DNA較易發(fā)生突變，其突變率比核DNA高出10至17倍，而且線粒體DNA本身不具備自我修復的能力。

目前，人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP（http://www.mitomap.org）收錄了60個已被證實的致病點突變。如果在檢測中發(fā)現(xiàn)了這些突變，并且臨床表型也符合，那么可以做出確診。鑒于線粒體遺傳多為母系遺傳，建議進行母系成員的致病突變檢測，同時采樣血液和尿液以避免假陰性結果。

然而，對于已有報道的突變，需要進行嚴格的分析，而不是盲目下診斷。首先，要確認臨床表現(xiàn)是否相符，其次要檢索突變是否影響蛋白結構和功能，并查看是否有相關的功能研究支持。舉例來說，我們曾診斷一名患有線粒體DNA耗竭綜合征的兒童，但檢測到的mtDNA G5821A 100％突變被文獻報道為與耳聾相關，與患者的臨床表現(xiàn)不符，且致病意義不明。因此，不能單純依據(jù)此突變進行診斷。

因此，對于通過mtDNA全基因組測序發(fā)現(xiàn)的突變，必須進行嚴格的篩查。只有那些在人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫MITOMAP中已被證實為致病性的突變才能做出確診，對于尚未經(jīng)過證實的突變，需要慎重評估后才能做出診斷。

針對核基因的靶向捕獲測序結果，如果發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有報道的致病性突變，并且該突變與患者的臨床表現(xiàn)和遺傳方式相符合，那么可以做出診斷。

然而，對于尚未報道過的新突變，臨床醫(yī)生需要結合遺傳學意義和臨床綜合分析，從以下幾個方面進行致病性的推測：

非已知的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)：查詢SNPs數(shù)據(jù)庫，并在大規(guī)模正常對照群體（如千人基因組或本地正常人）中確認未檢測到此變異。

突變對蛋白結構和功能的影響：此類突變可能包括移碼、剪切、缺失和無義突變，或者經(jīng)過功能預測軟件預測位于高度保守區(qū)、導致氨基酸變異較大的錯義突變。

符合孟德爾遺傳特征：突變符合孟德爾遺傳規(guī)律，即在家系中呈現(xiàn)經(jīng)典的遺傳模式。

通過以上分析，可以對新突變的致病性進行初步的推測和評估。

無論是傳統(tǒng)測序還是二代測序診斷線粒體病，其確診率仍然維持在30%左右。線粒體的結構和功能涉及1500多個基因，但目前已發(fā)現(xiàn)的致病基因僅有200余個，這意味著基因診斷率并不高。 對于那些基因檢測結果為陰性，但臨床上仍然高度懷疑患有線粒體病的患者，需要進行組織標本的酶活性檢測。呼吸鏈酶復合物I是其中分子量賊大、結構賊復雜的部分，含有44個亞基。已經(jīng)確定其中有7個亞基由線粒體基因編碼，另外由核基因編碼的16個亞基基因突變與線粒體病有關，但其余的亞基致病性尚不清楚，這意味著大約一半的亞基的致病性還不為人所知。 

綜上所述，線粒體病是一種臨床和遺傳異質(zhì)性較高的疾病。在診斷典型線粒體綜合征時，應首先選擇敏感的組織進行熱點突變篩查，而不是盲目進行二代測序。 隨著遺傳學檢測技術的飛速發(fā)展，檢測成本不斷降低，檢測時間不斷縮短，這為遺傳異質(zhì)性較強和罕見的線粒體病帶來了新的機遇和發(fā)展。相信在不久的將來，會有越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)，越來越多的線粒體病得到診斷。這不僅將為患者的治療和預后評估提供重要依據(jù)，還將為患者及其家屬提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷服務。同時，這也將為線粒體病發(fā)病機制和靶向治療的研究奠定基礎。