【佳學(xué)基因檢測】恩諾單抗（Enfortumab Vedotine）基因檢測靶向治療膀胱癌

靶向藥物基因檢測導(dǎo)讀：

恩諾單抗(enfortumab vedotin-ejfv)是針對腫瘤物靶點(diǎn)Nectin-4的一種屬于免疫單抗藥物的腫瘤靶向治療工具。該藥物的中名稱還包括：恩福妥單抗維多汀?；蚪獯a表明Nectin-4是一種位于細(xì)胞表面的粘附蛋白。Nectin 細(xì)胞粘附蛋白 4 (Nectin-4) 在多種人類惡性腫瘤中過度表達(dá)。 這種異常表達(dá)與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。 Nectin-4 已成為一種潛在的生物標(biāo)志物和有前途的靶向治療。 臨床前模型一致證明 Nectin-4 位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。 此外，無論實(shí)體瘤的位置如何，Nectin-4 都會過表達(dá)。 有趣的是，在膀胱尿路上皮癌中突出了 Nectin-4 表達(dá)的異質(zhì)性。 高血清 Nectin-4 水平與治療效率和疾病進(jìn)展相關(guān)。 最后，生成的抗藥物綴合靶向 Nectin-4 在多種腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。 Nectin-4 因其在腫瘤發(fā)生和淋巴管生成中的核心作用而成為抗癌藥物開發(fā)的有希望的靶標(biāo)。 以 Nectin-4 為靶點(diǎn)的 Enfortumab vedotin 顯示出令人鼓舞的結(jié)果，應(yīng)該擴(kuò)展到其他類型的實(shí)體瘤。

恩諾單抗靶基因在膀胱癌的表達(dá)研究：基因檢測的科學(xué)依據(jù)

由NECTIN4基因（以前稱為PVRL4）編碼的表面蛋白 NECTIN4 是一種免疫球蛋白樣跨膜蛋白，在尿路上皮癌中高度表達(dá)，最近已成為新的藥物靶點(diǎn)。Enfortumab vedotin（EV；以前稱為 ASG-22CE）是一種抗體-藥物偶聯(lián)物 (ADC)，可將單甲基 auristatin E (MMAE)（一種微管去穩(wěn)定劑）遞送至表達(dá) NECTIN4 的腫瘤細(xì)胞。最近一項(xiàng)恩諾單抗的 II 期臨床試驗(yàn)單藥療法 (EV-201) 在經(jīng)過大量預(yù)處理的轉(zhuǎn)移性或局部晚期尿路上皮癌患者中表現(xiàn)出 44% 的總體反應(yīng)率，這導(dǎo)致 FDA 加快批準(zhǔn)。 正在進(jìn)行多項(xiàng)附加試驗(yàn)，以評估局部晚期和轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌使用或不使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑和/或鉑類化療的 EV。 隨著恩諾單抗進(jìn)入早期疾病狀態(tài)并納入一線環(huán)境，了解分子預(yù)測對恩諾單抗的反應(yīng)和描述耐藥機(jī)制的特征對于最大化臨床療效至關(guān)重要。

NECTIN4 在膀胱癌中的表達(dá)尚未明確，迄今為止有限的研究顯示出相互矛盾的結(jié)果。雖然幾乎所有參加 EV-201 的患者 (97%) 都有可檢測到的 NECTIN4 H 分?jǐn)?shù)（中位數(shù) 290；范圍 14-300）， 似乎存在表達(dá)差異。在一項(xiàng)針對 524 例原發(fā)性膀胱腫瘤的研究中，僅 63% 的樣本具有中度至強(qiáng) H 評分 (H≥100)。此外，最近的病例系列發(fā)現(xiàn) NECTIN4 染色高度可變——僅 24%純尿路上皮癌具有中等至強(qiáng)的 H 評分 (H≥100)，而具有混合組織學(xué)的腫瘤的尿路上皮成分具有弱和異質(zhì)染色。 

尿路上皮癌的分子亞型突出了致癌機(jī)制、免疫浸潤和臨床病理學(xué)特征的根本差異。最近，描述了六種關(guān)鍵的共識亞型：管腔乳頭狀 (LumP)、管腔非特異性 (LumNS)、管腔非特異性不穩(wěn)定 (LumU)、基底/鱗狀 (Bas/Sq)、富含基質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌樣（NE 樣）。NECTIN4 是否在尿路上皮癌的六種分子亞型中普遍且一致地表達(dá)仍然未知。佳學(xué)基因解碼基因檢測分析了七個(gè)臨床數(shù)據(jù)集中的NECTIN4基因表達(dá)，包括順鉑后新輔助化療隊(duì)列。 基因解碼的目標(biāo)是檢查不同膀胱癌亞型的表達(dá)差異，并確定單獨(dú)調(diào)節(jié)NECTIN4表達(dá)水平是否會改變對恩諾單抗的敏感性和耐藥性。
 

NECTIN4 富含肌肉浸潤性膀胱癌的管腔亞型

為了評估跨分子亞型的NECTIN4 mRNA 表達(dá)，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略分析了七組局限性膀胱腫瘤患者的NECTIN4 mRNA 表達(dá)。使用共識分類器亞型，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)管腔腫瘤（LumP、LumNS、LumU）與基礎(chǔ)、NE 樣或富含基質(zhì)的亞型相比具有更高的NECTIN4 mRNA 基因表達(dá)。使用 TCGA、Lund 和 Decipher 分類器進(jìn)行的分子分型也表明NECTIN4 mRNA 在管腔亞型中的高表達(dá)。在先前接受過基于順鉑的新輔助化療（NAC 后）的患者中，NECTIN4 mRNA 表達(dá)在治好性膀胱切除術(shù)標(biāo)本的管腔樣簇 (CC2) 中也最高。有趣的是，驅(qū)動(dòng)膀胱癌管腔細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄因子（ GATA3、PPARG、FOXA1）的表達(dá)水平與多個(gè)隊(duì)列中的NECTIN4表達(dá)呈正相關(guān)。在可獲得回顧性臨床數(shù)據(jù)的隊(duì)列中，未發(fā)現(xiàn)NECTIN4表達(dá)的四分位數(shù)與總生存期之間存在顯著關(guān)聯(lián)。膀胱癌組織微陣列 (TMA) 中 NECTIN4 蛋白的免疫組織化學(xué)染色也顯示出顯著的表達(dá)異質(zhì)性。NECTIN4 蛋白主要定位于陽性腫瘤的細(xì)胞表面，H 評分與分子亞型相關(guān)，在管腔亞型中發(fā)現(xiàn) NECTIN4 蛋白表達(dá)最高。

泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略還發(fā)現(xiàn)，與 Seiler 隊(duì)列中的女性相比，男性患者的NECTIN4 mRNA 表達(dá)更高，并且與 MOL 隊(duì)列中的 pT2 腫瘤相比，患有病理性 T1 期腫瘤的患者更高。NECTIN4 mRNA 表達(dá)在其他臨床變量（包括年齡和臨床分期）中的差異在這些隊(duì)列中并不顯著。

NECTIN4 表達(dá)在人管腔膀胱癌細(xì)胞中富集

人膀??胱癌細(xì)胞系已分為管腔型和基底亞型。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)NECTIN4 mRNA 表達(dá)在管腔型膀胱癌細(xì)胞系中也有所增加（p<0.0001）, 與管腔轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)密切相關(guān)（n=36 尿路上皮癌細(xì)胞系，p=0.00007）并且對細(xì)胞存活不是必需的（基于數(shù)百個(gè)細(xì)胞系的 RNAi 敲低和 CRISPR 敲除）。與基底細(xì)胞系（253JBV、UMUC-3 和 TCCSUP）相比，管腔細(xì)胞系（UMUC-9、HT-1197 和 HT-1376）的細(xì)胞表面內(nèi)源性 NECTIN4 蛋白水平也顯著更高，這與總蛋白表達(dá)相關(guān)水平。

Luminal 細(xì)胞以具有更多上皮形態(tài)的粘聚簇生長，而基底細(xì)胞具有紡錘形、間充質(zhì)形態(tài)。有趣的是，根據(jù) mRNA 表達(dá)，一些歸類為基礎(chǔ)的膀胱癌細(xì)胞系（即 UMUC-14、VMCUB1 和 647V）也表達(dá)NECTIN4 。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略驗(yàn)證了其中兩個(gè)細(xì)胞系（UMUC-14 和 647V）中 NECTIN4 的細(xì)胞表面和總蛋白表達(dá)，與 HT-1376 細(xì)胞相比，它們在細(xì)胞表面表達(dá)可檢測但較低的 NECTIN4 蛋白。647V 細(xì)胞看起來更像管腔，而 UMUC-14 細(xì)胞與 UMUC-3 和 TCCSUP 細(xì)胞相比表現(xiàn)出中間形態(tài)，這與 NECTIN4 在細(xì)胞粘附中發(fā)揮作用一致。

NECTIN4 表達(dá)對于恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是必要且充分的

然后泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略研究了管腔細(xì)胞和基底細(xì)胞是否對恩諾單抗具有不同的基線敏感性，發(fā)現(xiàn) HT-1376 和 HT-1197 管腔細(xì)胞（高內(nèi)源性 NECTIN4）對恩諾單抗比 UMUC-3 和 TCCSUP 基底細(xì)胞（幾乎沒有內(nèi)源性 NECTIN4）更敏感), 具有很強(qiáng)的抗性。此外，盡管可檢測到 NECTIN4 表達(dá)水平，但基礎(chǔ) UMUC-14 細(xì)胞對恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有抗性，而與 HT-1376 細(xì)胞相比，647V 細(xì)胞具有中等敏感性（IC 50 ~3 μg/mL）。綜上所述，這些結(jié)果表明NECTIN4 mRNA 和蛋白表達(dá)在管腔膀胱癌細(xì)胞系中更高，因此，它們對恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也更敏感。

接下來，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略詢問luminal HT-1376 細(xì)胞中NECTIN4的敲低是否可以消除對恩諾單抗的敏感性。為此，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略生成了表達(dá)催化失活 dCas9（稱為 CRISPR 干擾或 CRISPRi）的 HT-1376 細(xì)胞，并使用 5 種獨(dú)特的 sgRNA 來沉默NECTIN4。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)所有 5 種 sgRNA 都有效地沉默了NECTIN4 mRNA 和 NECTIN4 細(xì)胞表面蛋白表達(dá) > 90%，如通過定量聚合酶鏈反應(yīng) (qPCR) 和表面蛋白染色檢測到的。NECTIN4敲低細(xì)胞保留了大致相似的管腔形態(tài)，具有一些紡錘形特征。

重要的是， NECTIN4的缺失導(dǎo)致了恩諾單抗耐藥性。具有強(qiáng)大NECTIN4表達(dá)的 HT-1376 對照細(xì)胞在 0.02 μg/ml 的恩諾單抗下被有效抑制，而 HT-1376 NECTIN4敲低細(xì)胞需要 1 μg/ml 的恩諾單抗才能被抑制，這代表了 25 倍的靈敏度差異。克隆形成試驗(yàn)證實(shí)了NECTIN4的缺失賦予對恩諾單抗的抗性的觀察結(jié)果。NECTIN4的缺失還導(dǎo)致第二種管腔膀胱癌細(xì)胞系 HT-1197 出現(xiàn)恩諾單抗耐藥性。

為了研究NECTIN4表達(dá)是否單獨(dú)介導(dǎo)恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略在基礎(chǔ) UMUC-3 細(xì)胞系中組成型表達(dá)NECTIN4 。表面蛋白染色和 qPCR 表明 NECTIN4 被強(qiáng)烈表達(dá)。

此外，通過免疫組化證實(shí)NECTIN4蛋白主要定位于UMUC3-NECTIN4過表達(dá)（OE）腫瘤異種移植物的細(xì)胞表面；在基底 UMUC3 對照腫瘤異種移植物中未發(fā)現(xiàn)可檢測的內(nèi)源性 NECTIN4 蛋白。重要的是，上調(diào)UMUC-3 細(xì)胞中的NECTIN4表達(dá)導(dǎo)致對恩諾單抗的敏感性顯著增加，如增殖所證明的那樣和克隆形成試驗(yàn)。

泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略在第二個(gè)基底膀胱癌系 TCCSUP 中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果?？傊?，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的結(jié)果表明NECTIN4表達(dá)是恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡所必需的，并強(qiáng)調(diào)了以下發(fā)現(xiàn)：i) NECTIN4的下調(diào)或缺失可能是一種重要的耐藥機(jī)制，并且 ii) 誘導(dǎo)NECTIN4表達(dá)會增加恩諾單抗敏感性。

 

關(guān)于恩諾單抗靶向藥物基因檢測對尿路上皮癌治療的影響

擴(kuò)大晚期尿路上皮癌的治療選擇仍然是一個(gè)關(guān)鍵的未滿足需求，正如恩諾單抗迅速納入三線轉(zhuǎn)移環(huán)境所表明的那樣。新輔助空間也為其他治療做好了準(zhǔn)備——60% 接受現(xiàn)有基于順鉑的方案治療的患者在治好性膀胱切除術(shù)中被發(fā)現(xiàn)有殘留的浸潤性疾病，在管腔型腫瘤中獲益不明顯。在這項(xiàng)研究中，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)跨分子亞型的NECTIN4表達(dá)存在顯著異質(zhì)性，在管腔癌中表達(dá)最高。NECTIN4還與GATA3、FOXA1和PPARG密切相關(guān)，這是已知決定管腔細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄因子。值得注意的是，NECTIN4在 NE 樣亞型中最低。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略還發(fā)現(xiàn)NECTIN4表達(dá)在后 NAC CC2 管腔分子亞型中仍然最高?？偠灾@種變異性可能反映了潛在腫瘤生物學(xué)的差異，并且對管腔腫瘤對基于恩諾單抗的新輔助或輔助治療方案的敏感性具有重要意義。有趣的是，>90% 的上尿路尿路上皮腫瘤也是管腔型的，可能表達(dá)更高水平的NECTIN4。

在這里，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)NECTIN4表達(dá)對于恩諾單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡至關(guān)重要。使用代表性的管腔（HT-1376、HT-1197）和基底（UMUC-3、TCCSUP）細(xì)胞系，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略證明管腔細(xì)胞中NECTIN4的敲低導(dǎo)致恩諾單抗抗性，而 NECTIN4 在基底細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致恩諾單抗敏感性。據(jù)泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略所知，這些數(shù)據(jù)新穎正式證明NECTIN4的表達(dá)是尿路上皮癌臨床前細(xì)胞系模型中恩諾單抗治療效果的關(guān)鍵決定因素。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的數(shù)據(jù)證實(shí)并建立在現(xiàn)有的臨床前體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)。有趣的是，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)一些基底細(xì)胞系表達(dá)NECTIN4 mRNA 和蛋白，包括 647V 和 UMUC-14 細(xì)胞。盡管 647V 細(xì)胞對恩諾單抗相對敏感，但 UMUC-14 細(xì)胞具有高度抵抗力，這表明可能還有其他因素會介導(dǎo)恩諾單抗敏感性（即對 MMAE 有效載荷的敏感性）。

泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的研究有幾個(gè)重要的局限性。首先，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略在超過 1,900 個(gè)臨床樣本中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)可能不一定反映 NECTIN4 表面蛋白表達(dá)。盡管如此，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略對幾種可用細(xì)胞系的表面蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)證實(shí) mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平強(qiáng)烈相關(guān)，這與之前證明 mRNA 和蛋白質(zhì)水平之間相關(guān)性的研究一致。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，使用膀胱癌 TMA 對 NECTIN4 蛋白進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色表明，在管腔亞型中具有更高的 NECTIN4 H 評分。其次，在這些隊(duì)列中分析的樣本是從原發(fā)性腫瘤組織中獲得的（由于數(shù)據(jù)可用性），可能不一定代表轉(zhuǎn)移性腫瘤中的表達(dá)水平。需要對轉(zhuǎn)移部位的活組織檢查進(jìn)行額外研究，以更好地表征原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間NECTIN4表達(dá)的異同。此外，不同轉(zhuǎn)移性病灶之間可能存在患者體內(nèi)表達(dá)的異質(zhì)性，這在分析單個(gè)活檢時(shí)未被充分認(rèn)識。雖然泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的數(shù)據(jù)表明NECTIN4之間存在相關(guān)性EV 在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的表達(dá)和反應(yīng)，未來的研究應(yīng)該旨在將泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的發(fā)現(xiàn)與臨床患者在局部和轉(zhuǎn)移環(huán)境中對恩諾單抗的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，并確定反應(yīng)所需的表達(dá)閾值。最后，必須承認(rèn)二維細(xì)胞培養(yǎng)的固有局限性，因?yàn)檫@些條件不能概括體內(nèi)腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞間相互作用。未來應(yīng)繼續(xù)研究三維細(xì)胞培養(yǎng)和患者來源的類器官模型。

可能存在對 ADC 治療的多種耐藥機(jī)制，包括靶標(biāo)表面蛋白表達(dá)的下調(diào)（即“抗原逃逸”）。例如，HER2表達(dá)降低已被證明是HER2靶向 ADC 的潛在耐藥機(jī)制，例如用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的曲妥珠單抗 emtansine。用 CD19 靶向 ADC 和嵌合抗原治療的 B 細(xì)胞惡性腫瘤患者的 CD19 缺失受體 (CAR)-T 細(xì)胞已被描述。鑒于NECTIN4的明顯異質(zhì)性表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞死亡所需的表達(dá)閾值也很重要，需要闡明。其他耐藥機(jī)制可能共存，包括受體內(nèi)化減少、藥物外排泵增加、內(nèi)體運(yùn)輸發(fā)生變化或?qū)τ行ж?fù)載的敏感性降低。最近的 CRISPR 篩選鑒定出許多內(nèi)體蛋白，包括 C18ORF8 / RMC1，是必需的用于 ADC 功效。有必要對恩諾單抗治療前后的腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查，以確定其他耐藥機(jī)制?；仔秃推渌乔恍湍蚵飞掀ぐ┗颊呤欠駥Χ髦Z單抗更具抵抗力仍有待確定。此外，在新輔助治療中，迫切需要針對 luminal 亞型的策略，因?yàn)檫@些腫瘤從鉑類化療中獲益較少。未來的EV臨床試驗(yàn)應(yīng)考慮結(jié)合分子亞型來預(yù)測治療反應(yīng)，并探索EV 在新輔助、輔助和膀胱內(nèi)治療環(huán)境中早期疾病狀態(tài)中的療效。

 

基因解碼基因檢測對膀胱癌等尿路上皮癌靶向藥物的選擇作用

泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的研究表明，NECTIN4 mRNA 表達(dá)在膀胱癌的管腔亞型（LumNS、LumP 和 LumU）中最高，并且在新輔助順鉑治療后的管腔腫瘤中持續(xù)升高。NECTIN4表達(dá)與幾種管腔轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)相關(guān)，包括GATA3、FOXA1和PPARG。在膀胱癌的細(xì)胞系模型中，NECTIN4表達(dá)水平與恩諾單抗敏感性相關(guān)。此外，在人管腔膀胱癌細(xì)胞系中，EV 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡需要NECTIN4 ，并且可以通過表達(dá)NECTIN4來誘導(dǎo)恩諾單抗敏感性在基底膀胱癌細(xì)胞系中。評估恩諾單抗療效的臨床試驗(yàn)應(yīng)強(qiáng)烈考慮在治療前對患者進(jìn)行分子亞型分類。

 

恩諾單抗（Enfortumab Vedotine）基因檢測靶向治療膀胱癌的要點(diǎn)

Enfortumab vedotin (EV) 是一種靶向 NECTIN4 的抗體藥物偶聯(lián)物，最近被批準(zhǔn)用于治療難治性轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌。NECTIN4 是一種與細(xì)胞間粘附有關(guān)的細(xì)胞表面蛋白，被認(rèn)為在原發(fā)性膀胱腫瘤中普遍表達(dá)。然而，在早期的臨床試驗(yàn)中，EV 的反應(yīng)率一直存在差異。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略試圖確定NECTIN4表達(dá)是否在膀胱癌的分子亞型中存在異質(zhì)性。使用來自 7 個(gè)臨床隊(duì)列和 >1,900 個(gè)患者樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略發(fā)現(xiàn)與基礎(chǔ)、神經(jīng)內(nèi)分泌或富含基質(zhì)的亞型相比，NECTIN4表達(dá)在膀胱癌的管腔分子亞型中最高。連接蛋白4表達(dá)對于尿路上皮癌管腔和基底細(xì)胞系模型中的恩諾單抗敏感性以及NECTIN4的下調(diào)誘導(dǎo)對恩諾單抗的抗性既是必要的也是充分的。泌尿科腫瘤治療的靶向藥物策略的研究結(jié)果支持使用分子亞型來預(yù)測恩諾單抗反應(yīng)，并可能對臨床試驗(yàn)中的患者選擇和生物標(biāo)志物開發(fā)產(chǎn)生影響。

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