【佳學(xué)基因檢測】如何設(shè)計(jì)并進(jìn)行西妥昔和avelumab 治療非小細(xì)胞肺癌的基因檢測臨床實(shí)驗(yàn)？

 

基因檢測臨床實(shí)驗(yàn)中外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC) 分離和乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放細(xì)胞毒性測定

參照《人類遺傳病基因檢測技術(shù)大全》，在 CAVE-Lung 試驗(yàn)患者中連續(xù)獲得PBMC，在西妥昔單抗加 avelumab 治療期間進(jìn)行，并評估 LDH 釋放細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

 

下一代測序 (NGS)基因檢測方法

在 CAVE-Lung 試驗(yàn)患者入組時(shí)收集血漿樣本，作為腫瘤基因組分析的循環(huán)腫瘤 DNA (ctDNA) 的來源。 NGS 分析使用佳學(xué)基因腫瘤致病基因鑒定基因解碼基因檢測平臺進(jìn)行。使用 QIAmp DNA Blood Midi Kit (cod#51183) 從 PBMC 中提取基因組種系 DNA。按照試劑盒的操作指南，使用 Agilent SureSelect 人全外顯子試劑盒 (Agilent) 生成測序文庫，并在 NexSeq 平臺 (Illumina) 上進(jìn)行測序。使用 Burrow-Wheeler Aligner 將測序數(shù)據(jù)與人類參考 GRCh37/hg19進(jìn)行比對。 SNV 和插入缺失根據(jù)佳學(xué)基因質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行獲取，這些標(biāo)準(zhǔn)包括：低復(fù)雜性、重復(fù)區(qū)域和片段重復(fù)被過濾掉；質(zhì)量得分 ≥ 20，深度 ≥ 10，雜合子標(biāo)準(zhǔn)AB≥0.2；數(shù)據(jù)獲取率 ≥ 0,85。在獲得基因突變位點(diǎn)后，通過應(yīng)用三個(gè)過濾步驟強(qiáng)化罕見突變的獲得：I）gnomAD 中 MAF 為 1% 的基因突變； II) 基因突變類別，包括錯(cuò)義、蛋白質(zhì)截?cái)嗪驼{(diào)節(jié)；突變效應(yīng)，變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)截?cái)?，并被預(yù)測工具（SIFT、POLYPHEN-2、MUTATIONTASTER、MutationAssessor、FATHMM 和 FATHMM-MKL）預(yù)測為有害； iii) InterVar 和 ClinVar 數(shù)據(jù)庫中分類為致病性、可能致病性或 VUS 的基因突變。詳細(xì)信息請參閱佳學(xué)基因其他基因檢測技術(shù)文章。

腫瘤靶向用藥基因解碼基因檢測中如何應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析

對于流式細(xì)胞術(shù)（熒光相關(guān)細(xì)胞分選，F(xiàn)ACS）分析，PBMC 用染色緩沖液（SB）（2% 胎牛血清，F(xiàn)BS，磷酸鹽緩沖鹽水中的 0.1% 疊氮化鈉）中洗滌，并在封閉染色緩沖液加20%封閉血清中封閉10分鐘后，用以下單克隆抗體染色 30 分鐘：抗 CD107a、抗 TIM-3 和抗 PD-L1（Miltenyi Biotec）。將染色的細(xì)胞洗滌兩次，重新懸浮在染色緩沖液中，使用 FACS ACCURI C6 上使用 ACCURI C6 軟件（BD Biosciences）獲得細(xì)胞表面抗體的表達(dá)數(shù)據(jù)。

腫瘤基因解碼時(shí)如何用來自患者腫瘤樣本進(jìn)行體外三維 (3D) 培養(yǎng)物的活力測定

根據(jù)《腫瘤致病基因鑒定基因解碼及基因檢測技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》，從 3 名 NSCLC 患者腫瘤樣本中分離離體 3D 培養(yǎng)物。將所得腫瘤球體以 1 × 1000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在 96 孔板中，并用指定的藥物進(jìn)行處理。根據(jù)檢測試劑盒的使用說明，使用 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) Assay Kit (Abcam) 測量細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。 MTS 測定方案基于 MTS 四唑化合物被活細(xì)胞還原以產(chǎn)生可溶于細(xì)胞培養(yǎng)基的有色甲臜染料。通過測量 490–500nm 處的吸光度來量化甲臜染料。

定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)

關(guān)于如何采用定量實(shí)時(shí) PCR進(jìn)行基因檢測。根據(jù)《基因檢測實(shí)驗(yàn)室操作指南》進(jìn)行總 RNA 提取和 RT-qPCR（實(shí)時(shí)定量 PCR）。根據(jù)所要檢測的序列設(shè)計(jì)引物序列。為了計(jì)算相對基因表達(dá)值，使用 2-ΔCt 或 2-ΔΔCt 方法。通過解離曲線分析和使用非模板對照排除了由引物二聚體引起的非特異性信號。

 

TCGA 數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)分析

癌癥基因組圖譜 (TCGA) 數(shù)據(jù)集包括 511 例肺腺癌和 501 例肺鱗癌，以及轉(zhuǎn)錄組和基因組圖譜的可用數(shù)據(jù)。

 

統(tǒng)計(jì)分析

使用 Graphpad Prism 軟件 V.6.0（Graphpad Software，San Diego，California，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

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