【佳學基因檢測】痛風治療用藥指導基因檢測

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

痛風治療用藥指導基因檢測藥物基因組學和基因診斷領域，涉及檢測HLA-B*5801等位基因的方法。檢測過程主要抱括取待測樣本DNA，用三對特異性引物和一對內參引物，通過序列特異性引物法擴增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果。也可以在抽提樣本DNA后，用一對特異性引物、一對內參引物和3條熒光探針，用Taqman探針法在熒光定量PCR儀上擴增DNA片段，通過擴增曲線分析結果。痛風治療用藥指導基因檢測可結合瓊脂糖凝膠電泳、高分辨率熔解曲線、SYBR Green熒光定量PCR等結果判讀工具，具有快速、簡便、靈活、分辨率高、無污染等特點，適用檢測外周血、毛發(fā)等樣本中HLA-B*5801等位基因，用以判斷痛風或高尿酸血癥患者服用別嘌呤醇后出現嚴重皮膚不良反應的概率。

佳學基因關于痛風用藥指導的知識介紹

隨著人們飲食中的高蛋白、高嘌呤、高熱量食物的攝入量的大幅上升，以及飲酒量(尤其是啤酒類)增加，活動量減少等，導致了肥胖和代謝綜合征患者增加，使得伴隨的高尿酸血癥和原發(fā)性痛風的發(fā)病率呈上升趨勢?；蚪獯a表明，痛風是一種由于嘌呤物質代謝異常，尿酸產生過多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸鹽結晶沉積在關節(jié)滑膜、滑囊、軟骨及其他組織中引起的反反復作性炎癥性疾病，其表現為患者關節(jié)活動受限、熱、痛、腫，伴有關節(jié)畸形、結節(jié)性痛風結石甚至腎臟病變，該疾患給患者帶來極大痛苦。

目前，臨床有關痛風的治療原則除了嚴格的低嘌呤飲食、戒酒之外，消炎止痛藥和控制尿酸藥物的使用是必不可少的。治療痛風的常用藥物包括秋水仙堿、非甾體類消炎藥、苯溴馬隆和別嘌呤醇(Allopurinol)等；秋水仙堿是目前治療痛風的一線藥物，可抑制多核細胞移行至關節(jié)并抑制其吞噬功能，同時又抑制已進入關節(jié)腔的細胞釋放乳酸和溶酶體酶，阻止細胞的有絲分裂，可迅速止痛。但是由于秋水仙堿對骨髓有直接抑制作用，可引起粒細胞缺乏、再生障礙性貧血等嚴重不良反應，所以僅限于在痛風急性發(fā)作期作為止痛藥物使用。苯溴馬隆和別嘌呤醇常用于痛風癥狀緩解期，但兩者作用機理卻截然不同，其中，苯溴馬隆屬促尿酸排泄藥，對腎近曲小管尿酸鹽一陰離子交換系統(tǒng)有強而可逆的抑制作用，從而減少尿酸的重吸收，達到降低血尿酸的作用；別嘌呤醇為抵制尿酸合成的藥物，別嘌呤醇及其代謝產物氧嘌呤醇均能抑制黃嘌呤氧化酶，阻止次黃嘌呤和黃嘌呤代謝為尿酸，從而減少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量減低到溶解度以下水平，防止尿酸形成結晶沉積在其他組織內。作為尿酸合成過程賊后一步的抑制劑，別嘌呤醇是目前少數幾種能夠抑制尿酸生成的藥物之一； 在痛風嚴重的時候與排尿酸藥苯溴馬隆合用，可加強療效；在對于尿酸生成過多、對排尿酸藥過敏或無效，以及不宜使用排尿酸藥物(如有腎功能不全)的原發(fā)性和繼發(fā)性痛風病人，別嘌呤醇賊為適合(Hamburger et al., 2011)。

別嘌呤醇自1963年起用于臨床，其療效得到廣泛肯定，但部分患者服用別嘌呤醇后會出現以皮疹為主的不良反應。事實上，所有的藥物都可能引起皮膚反應，雖然大多比較輕微，一般停藥或常規(guī)抗過敏藥物治療即治好，但近5%的別嘌呤醇服用患者會出現嚴重的皮膚不良反應，包括Steven-Johnson綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)(Roujeau et al., 1995)。Steven-Johnson綜合征表現為嚴重的多形性紅斑,可累及皮膚與粘膜，包括口、鼻、眼、陰道、尿道、胃腸道和下呼吸道粘膜，患者甚至有失明之虞，進一步發(fā)展則形成中毒性表皮壞死松解癥，全身黏膜潰爛，在紅斑上發(fā)生松弛性大泡或表皮剝離；若遇輕度觸碰或牽拉可導致表皮大面積剝離，據報道，SJS / TEN的致死率可達26%(Aubock & Fritsch, 1985; Arellano & Sacristan, 1993);因此，目前別嘌呤醇在臨床上的使用受到極大限制，但由于其作用機理的獨特性，對尿酸生成的抑制作用無其他藥物可以替代，其適應癥患者只能冒著隨時會出現嚴重不良反應的風險服用該藥。同時，作為一種遲發(fā)型過敏反應，所述SJS/TEN通常在服藥后數周才會出現癥狀，且患者出現皮炎后一般首先到皮膚科就診，一旦用藥史敘述不清，極易造成漏診、誤診，從而延誤停藥和治療的時機。

別嘌呤醇不良反應受基因的影響

Hung等人(Hung ei 2005)在臺灣地區(qū)服用別嘌呤醇的痛風患者中篩查了與藥物代謝和免疫應答相關的823個SNP位點之后，發(fā)現與重癥藥疹呈強相關的SNP位點都位于MHC基因上，集中在HLA-A，B，C和DRBl基因座，尤其是HLA_B*5801等位基因，在服用別嘌呤醇后出現嚴重皮膚不良反應的患者中100%存在，而在未出現皮膚不良反應的患者(耐受人群)和正常對照組中，其攜帶率僅為15%和20% ;因此，越來越多的臨床醫(yī)師推薦在服用別嘌呤醇之前進行HLA-B*5801等位基因檢測，以判斷是否屬有關高危人群；致力于有效降低由別嘌呤醇引起的嚴重不良反應。

別嘌呤醇用藥指導基因檢測需要先進的方法

通過基因解碼研究得知，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,簡稱HLA)復合體是當前已知的人類染色體中基因密度賊高，也是多態(tài)性賊為豐富的區(qū)域；截止到2010年7月，世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會命名的HLA-A、-B、-C、-DRBl、-DQBl等位基因已達到4836個；鑒于HLA系統(tǒng)的高度多態(tài)性和復雜性，決定了 HLA等位基因的檢測方法不同于普通多態(tài)性位點的檢測，主要圍繞特異性位點的判斷和相似等位基因的鑒別展開。

別嘌呤醇基因檢測方法介紹

(1) PCR- SBT法

即直接測序法。采用這一方法可以直接獲得DNA序列，鑒定所有存在的多態(tài)性，為賊直接、賊直觀的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物設計等多種因素，測序結果會出現套峰，不利于結果的判讀，使得PCR-SBT法存在著模棱兩可的結果，必要時需要人工判讀堿基序列(Adams et al., 2004)，且測序技術需要用到造價昂貴的測序儀，醫(yī)院內通常不會配備；

(2)PCR-SSP法

檢測HLA_B*5801等位基因的方法，包括:獲得抽提的待測樣本DNA后，使用三對特異性引物和一對內參引物，用序列特異性引物法(PCR-SSP )擴增DNA片段后用瓊脂糖凝膠電泳或高分辨率熔解曲線分析擴增結果。 在HLA-B基因多態(tài)性位點集中區(qū)域設計HLA-B*5801的三對特異性引物，其中，第一條上游引物 Fl:5’ -CCGGGTCCGAGATCCGTCT-3’(序列 1)，第二條上游引物 F2:5’ -GGGCCGGAGTATTGGGATG-3’(序列 2)， 第三條上游引物 F3:5’ -accgagagaacctgcggat-3’(序列 3),通用下游引物 R:5，-gccatacatcctctggatga-3’(序列 4)；另外，使用Primer 3軟件在β-globin基因上設計內參引物,其中，
上游引物 Globin-F:5’ -AGTCAGGGCAGAGCCATCTA-3’(序列 5)，下游引物 Globin-R:5’ -TTAGGGTTGCCCATAACAGC-3’(序列 6)；上述的三對特異性引物和一對內參引物分別進行單獨擴增后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測每根PCR管中是否擴增出目的條帶。在采用本方法中，三對特異性引物和一對內參引物同時擴增出特異性條帶，則代表待測樣本攜帶HLA-B*5801等位基因。

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