【佳學(xué)基因檢測(cè)】如何清楚注釋基因檢測(cè)中的意義未明突變？

基因解碼技術(shù)導(dǎo)讀：

在基因檢測(cè)，這里包括致病基因鑒定基因檢測(cè)、用藥指導(dǎo)基因檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基因檢測(cè)及天賦基因檢測(cè)，都需要對(duì)個(gè)體中出現(xiàn)的基因序列變化做出生理和功能學(xué)意義的解釋。這種解釋又叫做注釋一種是數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)策略，這種策略依賴(lài)于病例和案例的積累，遵循證醫(yī)學(xué)方面的證據(jù)要求。一種是基因解碼策略，采用智能化數(shù)據(jù)分析。前者無(wú)法解釋個(gè)體特異性突變，而后者提供了可以窮盡所有突變可能的潛力。但是基因解碼技術(shù)僅在少數(shù)基因分析機(jī)構(gòu)中得到使用。 

基因解碼技術(shù)開(kāi)發(fā)中大量飼喂數(shù)據(jù)的獲取

在進(jìn)行基因解碼基因檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證中，采用來(lái)自各種數(shù)據(jù)庫(kù)（如dbSNP、ENSEMBL、SNP500 cancer、GeneCards和UniPort）的單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)。使用這些數(shù)據(jù)庫(kù)的好處是，它們定期更新信息，并且可以獲得與其他方式方法進(jìn)行比較的一致性數(shù)據(jù)。特別地，ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)用于根據(jù)早期研究者的方法獲取與HRAS基因相關(guān)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列，可以探索基因變異及其潛在影響提供前景。

如何分析nsSNPs基因突變對(duì)人體結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)的有害性影響

使用SIFT工具對(duì)非同義SNP對(duì)突變蛋白的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)。該技術(shù)根據(jù)同源比對(duì)將SNP分為兩類(lèi)：不耐受和耐受。具體而言，歸一化概率值低于指定閾值的氨基酸被確定為不耐受，而耐受指數(shù)大于0.05的被認(rèn)為是耐受的。這種方法的意義在于評(píng)估基因變異及其產(chǎn)生的表型結(jié)果的影響。

采用結(jié)構(gòu)同源性的分析方法分析nsSNPs突變的病學(xué)意義

利用PolyPhen2工具預(yù)測(cè)nsSNPs對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的有害影響。這種預(yù)測(cè)基于樸素貝葉斯算法，涉及將分?jǐn)?shù)分類(lèi)為0到1之間。根據(jù)分?jǐn)?shù)的大小將突變被分為三類(lèi)，其中分?jǐn)?shù)賊接近1的被確定為可能有害，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。采用這一認(rèn)知模型可以研究遺傳變異及其對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能的影響。

對(duì)nsSNPs基因突變的生理功能進(jìn)行分析

采用在線分析功具（包括SNP&GO、PhD-SNP、PROVEAN、PANTHER和P-Mut）來(lái)識(shí)別功能性nsSNPs。特別地，PhD-SNP依靠支持向量系統(tǒng)對(duì)非同義SNPs對(duì)蛋白質(zhì)的影響進(jìn)行分類(lèi)和描述。這種方法將nsSNPs分為有害或中性?xún)深?lèi)。此外，ROVEAN工具通過(guò)將突變根據(jù)-2.5的閾值分?jǐn)?shù)分類(lèi)為有害或中性，用于識(shí)別有害SNPs。同時(shí)，SNP&GO依靠支持向量機(jī)算法。P-MUT利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法根據(jù)序列的概率統(tǒng)計(jì)將突變體分為疾病或中性。這些技術(shù)在遺傳變異及其對(duì)蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的影響方面進(jìn)行評(píng)估。

蛋白編碼區(qū)的nsSNPs鑒定

使用SNP SnpEff和SnpSift工具包（http://pcingola.github.io/SnpEff/）根據(jù)早期研究者的方法，預(yù)測(cè)nsSNPs對(duì)HRAS蛋白編碼區(qū)的影響。除了展示保守性分?jǐn)?shù)的結(jié)果外，該程序還確定了蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的情況。SNP效應(yīng)使用了多種軟件和工具來(lái)發(fā)現(xiàn)突變體的聚集傾向，例如通過(guò)TANGO評(píng)估變異體的聚集傾向，通過(guò)WALTZ評(píng)估淀粉樣傾向，以及通過(guò)LIMBO評(píng)估伴侶結(jié)合情況。這些復(fù)雜的方法可以從遺傳變異與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間的復(fù)雜相互作用來(lái)解釋基因檢測(cè)突變的影響。

 非同義突變對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響（INPS）

使用I-MUTANT 3.0套件（https://bio.tools/i-mutant_suite）來(lái)預(yù)測(cè)突變對(duì)HRAS蛋白穩(wěn)定性的影響，使用MUpro程序（https://mupro.proteomics.ics.uci.edu/）進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證性分析。這兩個(gè)認(rèn)知模型依靠相同的算法，旨在評(píng)估突變對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，即可以發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的影響也可以評(píng)估降低的結(jié)果。
 

突變蛋白的保守性分析

使用ConSurf服務(wù)器（https://consurf.tau.ac.il/consurf_index.php）對(duì)發(fā)生了突變的蛋白中每個(gè)氨基酸的保守性和進(jìn)化特征進(jìn)行了全面分析。結(jié)果以不同的保守性分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)，范圍從1到9。分?jǐn)?shù)從1到3對(duì)應(yīng)可變位置，而分?jǐn)?shù)從4到6表示適度保守的氨基酸位置。此外，分?jǐn)?shù)在7到9的范圍內(nèi)表示高度保守的氨基酸位置。利用這一先進(jìn)技術(shù)可以進(jìn)一步的分析突變位置在蛋白質(zhì)進(jìn)化和保守性進(jìn)行評(píng)估，從而擴(kuò)展加強(qiáng)基因解碼基因檢測(cè)對(duì)遺傳與蛋白質(zhì)功能之間復(fù)雜相互作用的認(rèn)識(shí)。

分子對(duì)接

佳學(xué)基因解碼通過(guò)分子對(duì)接分析研究突變對(duì)含有突變的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，基因解碼從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了發(fā)生了突變的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。按照早期研究者的方法，將其轉(zhuǎn)換為MOE軟件（https://www.chemcomp.com/Products.htm）的格式。在對(duì)接過(guò)程中，基因解碼從結(jié)構(gòu)中排除了異原子、配體和水分子。使用確定的參數(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，包括能量賊小化（梯度為0.1）、添加氫原子以及使用MMFF94X力場(chǎng)。進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)活性位點(diǎn)，包括參與關(guān)鍵的相互作用的氨基酸殘基。

利用MOE軟件，基因解碼基因檢測(cè)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)和突變分子進(jìn)行了分子對(duì)接模擬，并將結(jié)果以mdb格式存儲(chǔ)以供進(jìn)一步分析。評(píng)分賊高的構(gòu)象經(jīng)過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，并利用評(píng)分函數(shù)（GBVI/WSA dg）計(jì)算結(jié)合自由能（ΔG）。評(píng)分函數(shù)基于多種分子相互作用，如π鍵、氫鍵和疏水相互作用。它提供了高效的評(píng)分方法，可以得到正確結(jié)合構(gòu)象的對(duì)接評(píng)分。

佳學(xué)基因解碼仔細(xì)研究對(duì)接復(fù)合物的MOE數(shù)據(jù)庫(kù)，以了解野生型和突變復(fù)合物的結(jié)合相互作用模式。這一分析方法使基因解碼能夠確定突變對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的可能影響，為進(jìn)一步的描述突變對(duì)致病性、用藥指導(dǎo)及天賦評(píng)估提供依據(jù)。

分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬

人工智能使用Schrodinger 2021.2軟件套件進(jìn)行計(jì)算研究。初始結(jié)構(gòu)是使用Maestro 12.8繪制的，并且在pH 7.4下使用Epik 3.2程序進(jìn)行了離子化處理，使用Ligprep 3.4（https://www.schrodinger.com/products/ligprep）進(jìn)行分析。這一分析流程是為分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬生成所需的起始結(jié)構(gòu)。

在模擬運(yùn)行過(guò)程中進(jìn)行計(jì)算，以生成不同時(shí)間間隔的MD模擬軌跡。在對(duì)接后，使用MacroModel 10.8模塊進(jìn)行了三個(gè)復(fù)合物的構(gòu)象研究。該模塊采用蒙特卡洛多重賊小值方法，使用扭轉(zhuǎn)采樣方法進(jìn)行構(gòu)象搜索。使用21 kJ mol1的能量限制去除了能量賊高的構(gòu)象。每個(gè)構(gòu)象賊多經(jīng)過(guò)2,000步的Polak-Ribiere共軛梯度技術(shù)縮小，梯度收斂閾值為0.001 kJ mol1 A?1，并且在此過(guò)程中使用了OPLS3力場(chǎng)。OPLS3力場(chǎng)對(duì)于小分子非常有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗峁┝苏_的能量賊小化潛能函數(shù)。

研究團(tuán)隊(duì)采用MD模擬評(píng)估酶-抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定性并探索蛋白質(zhì)-配體相互作用的構(gòu)象特征。利用數(shù)據(jù)縮減技術(shù)（如均方根偏差（RMSD）、均方根波動(dòng)（RMSF）、旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）和β因子值）評(píng)估模擬復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的構(gòu)象變化和穩(wěn)定性指數(shù)。佳學(xué)基因使用一套計(jì)算軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，并詳細(xì)研究蛋白質(zhì)-配體相互作用的構(gòu)象特征。采用多種技術(shù)評(píng)估模擬復(fù)合物的穩(wěn)定性和構(gòu)象變化。