【佳學基因檢測】單純性大皰性表皮松解癥基因檢測Epidermolysis bullosa simplex

遺傳病、罕見病基因檢測導讀：

大皰性表皮松解癥 (EB)基因檢測是對一種罕見的遺傳病所進行的基因測序分析，并對發(fā)現的基因突變進行致病性確定。大皰性表皮松解癥臨床表現差異很大，難以建立起基因型和表型之間的清晰的關系。佳學基因檢測通過不斷為不同的患者進行檢測，從而確立基因型與表型之間的關系。在本案例中，一個中國家庭中的兩名成員被診斷出患有局限性單純性 EB（EBS），其臨床表現包括從嬰兒期起腳底出現水皰和糜爛。案例中采用的基因檢測包括兩名患者、其他健康家庭成員和 100 名正常對照。從每個參與者身上分離出基因組 DNA 樣本，然后進行聚合酶鏈反應 (PCR) 直接測序。PCR 直接測序基因檢測結果顯示， KRT5外顯子 7 的密碼子 461 發(fā)生了新的雜合錯義突變（c.1382T>C），導致 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 患者發(fā)生氨基酸變化（p.L461P），但未受影響的患者和100 個無關的對照樣本則不存在該突變

單純性大皰性表皮松解癥基因檢測關鍵詞：

單純性大皰性表皮松解癥，角蛋白 5，突變

單純性大皰性表皮松解癥基因檢測介紹

根據《皮膚病的臨床圖譜及其基因檢測項目推薦》，大皰性表皮松解癥 (EB) 包括一組遺傳性疾病，其中水泡自發(fā)出現或在輕微損傷或摩擦后出現。大皰性表皮松解癥 (EB) 的表型譜變化很大，不同類型大皰性表皮松解癥 (EB) 的嚴重程度和相關的外來表現存在差異。然而，所有類型的大皰性表皮松解癥 (EB) 都存在外傷性水泡和脆性。根據相對于基底膜的真皮-表皮分離程度，大皰性表皮松解癥 (EB) 可分為四種亞型——單純型、交界型、營養(yǎng)不良型和金德勒綜合征. 在賊常見的亞型大皰性表皮松解癥 (EB) 單純性 (EBS) 中，分離發(fā)生在表皮角質形成細胞基底層或基底層之上。1986年至2002年的統(tǒng)計顯示，大皰性表皮松解癥 (EB)的患病率約為每100萬居民11例，發(fā)病率約為每100萬活產19例。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 顯示出顯著的遺傳和臨床異質性。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 可細分為全身重癥 (Dowling-Meara)、全身中度 (Koebner) 和局部亞型. 局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) (OMIM 131800) 是賊溫和的亞型，其中大皰性病變通常發(fā)生在出生或嬰兒期，但也可能出現在青春期或成年早期。臨床上，水泡和大皰主要局限于手掌和足底區(qū)域，沒有指甲和粘膜損傷。

幾乎所有 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 突變都遵循常染色體顯性遺傳模式。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 主要與兩個基因KRT5和KRT14的突變有關。KRT5和KRT14基因分別編碼基底表皮角蛋白 5 和 14。角蛋白 5 和角蛋白 14 都具有中央桿狀 α 螺旋結構和兩側的非螺旋結構（頭部和尾部）。在中心棒狀區(qū)域的開始和末端，有兩個高度保守的氨基酸序列，稱為螺旋起始肽（HIP）和螺旋終止肽（HTP）. 在大多數情況下，突變的位置決定了臨床表型的嚴重程度。例如，影響角蛋白絲組裝的 HIP 和 HTP 突變導致賊嚴重的 Dowling-Meara 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)（EBS-DM；OMIM 131760）；突變通常會導致非螺旋接頭區(qū)域的局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，而 Koebner（EBS-K；OMIM 131900）突變更廣泛地分布在角蛋白 5 和角蛋白 14 多肽上。迄今為止，佳學基因已經記錄了超過 150 種與這些基因相關的不同致病突變，其中大多數與更嚴重的 EBS-DM 相關。

在單純性大皰性表皮松解癥基因檢測中，對來自中國家庭的兩名被診斷為局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的患者進行了基因檢測分析，發(fā)現位于 KRT5 2B 區(qū)段的新型錯義突變 c.1382T>C (p.L461P) 證實了局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的診斷。新突變和基因型-表型關聯的鑒定有助于更好地了解局部單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的潛在病理生理學基礎，對于疾病進程預測、基因診斷、遺傳咨詢和基因治療非常重要。

臨床評估和 DNA 取樣

總共有五個局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 患者是這次單純性大皰性表皮松解癥基因檢測研究的對象（圖1) 參加了這項研究。成員 II:1（42 歲女性）和 III:1（15 歲女性；先證者）到佳學基因合作醫(yī)院就診。佳學基因檢測的分析還包括先證者的父親、祖父母和 100 名正常對照受試者。從所有參與的個人（或其監(jiān)護人）獲得書面知情同意書，并從每個參與者抽取 5 毫升抗凝靜脈血用于 DNA 提取。所有參與者的臨床檢查均由皮膚科醫(yī)生進行。研究的程序和過程遵照赫爾辛基宣言的原則進行的，得到了??醫(yī)院機構審查委員會的授權。我們收到了患者關于發(fā)布所有攝影材料的同意書。銅陵市人民醫(yī)院倫理委員會 (2020001) 獲得倫理批準。

圖1:家族血統(tǒng)。家譜顯示了三個世代中的兩個受影響的成員。未填充的符號代表譜系中未受影響的成員；深色符號表示受影響的成員。圓圈和正方形分別代表女性和男性。系譜的先證者已用紅色箭頭標記。

突變分析和多序列比對

我們使用聚合酶鏈式反應 (PCR) 來擴增基因組 DNA 樣本（Humphries 等人，1996 年），之后用 Sanger 測序對 PCR 產物進行測序。咨詢國家生物技術信息中心 (NCBI) cDNA 參考序列NM_000424.3用于KRT5和NM_000526.4用于KRT14，我們確定了僅存在于受臨床影響的家庭成員中的特定突變。多個在線生物信息學軟件程序，包括以下 PolyPhen2 ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 )、SIFT ( http://sift.bii.a-star.edu.sg ) 和 Mutation Taster ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 ) ://www.mutationtaster.org/), 用于預測由此產生的氨基酸取代是否會對 KRT5 和 KRT14 的結構和功能產生影響。我們比對了不同物種的蛋白質，包括Bos taurus、Gallus gallus、Gorilla gorilla、Mus musculus和Oryctolagus cuniculus。野生型和突變型 (p.L461P) 之間的結構變化由 SWISS-MODEL ( https://swissmodel.expasy.org , PBD: 3TNU) 預測。野生型和突變型的結構比較揭示了它們之間的顯著差異。

受影響患者的表型特征

這個家庭有兩個受影響的人。先證者是一名 15 歲的中國女孩，是無血緣關系的中國父母的獨生女。她和她媽媽有相似的臨床癥狀，沒有其他家族史。自出生以來，先證者和她的母親在足部受到機械損傷后容易出現水泡，但水泡愈合后空白痕。癥狀在夏季更嚴重，并隨著年齡的增長而改善。身體檢查除水泡外均正常（圖 2). 先證者右足底水皰病理檢查示表皮角化過度，顆粒層和棘層增厚，表皮內形成水泡。真皮乳頭層血管輕度擴張，炎性細胞浸潤少，血管周圍間質輕度黏液性（圖 2)本病的診斷是結合典型的臨床表現、家族史和病理檢查，故診斷為局限性單純性大皰性表皮松解癥(EBS)。我們進行的分子測試進一步證實了診斷。

圖 2: 局限性單純性大皰性表皮松解癥患者的臨床表現。圖中的水泡已用紅色箭頭標記。(A) 在先證者的右腳上觀察到水泡和糜爛。(B) 在母親的左腳底發(fā)現了類似的水泡。(C)表皮上皮過度角化，棘層增厚，表皮內有小泡(H&E, ×40)。(D) 裂隙位于表皮內 (H&E, ×200)。

突變分析和蛋白質結構建模

局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 是 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 賊常見的臨床變異性疾病之一，也是賊輕的一種。根據已發(fā)表的數據，許多基因的突變與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 表型相關，包括TGM5、PLEC、PKP1、KRT5、KRT14、DSP、JUP、DST和EXPH5，但超過 75% 的 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 病例歸因于 KRT5 的突變或KRT14基因¹²。因此，我們在這里選擇這兩個基因作為候選致病基因來篩選突變。

先證者 DNA 的分子分析表明，在KRT5基因外顯子 7 的核苷酸位置 1382 (c.1382T>C) 存在雜合的 T 到 C 轉變。該突變導致密碼子 461 (p. Leu461Pro) 的脯氨酸殘基被亮氨酸取代。在先證者的母親中檢測到KRT5中的相同突變。該突變位于KRT5的 2B 區(qū)段，證實了局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的診斷。在KRT5或KRT14中未發(fā)現其他突變。在未受影響的家庭成員或 100 名人口匹配的健康對照中未發(fā)現突變（圖 3). PolyPhen2 ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2 )、SIFT ( http://sift.bii.a-star.edu.sg ) 和 Mutation Taster ( http://www.mutationtaster.org/ ) 都預測突變 c.1382T>C (p.L461P) 可能會破壞蛋白質功能，盡管脯氨酸和亮氨酸具有相似的極性。

圖 3:KRT5突變分析。分子分析表明KRT5基因中存在從頭雜合錯義突變 c.1382T>C (p.Leu461Pro) 。(A) 未受影響的成員，(B) 受影響的成員。

我們比較了來自不同物種的蛋白質，并獲得了來自不同物種的 KRT5 的基于結構的多序列比對，表明突變 (p. l 461pro) 位于高度保守的區(qū)域 (圖 4).

圖 4：來自不同物種的 KRT5 的多序列比對。來自不同物種的 KRT5 基于結構的多序列比對顯示突變 (p.Leu461Pro) 位于高度保守的區(qū)域內。

在野生型 KRT5 中，Leu461 與 Met457 和 Val465 形成兩個氫鍵，而突變體 Pro461 僅與 Val465 形成一個氫鍵。氫鍵的減少可能會影響 2B α 螺旋結構域的穩(wěn)定性，其空間結構由氫鍵維持（圖 5). c.1382T>C(p.L461P)突變發(fā)生在非螺旋連接區(qū)，同極性的脯氨酸取代了亮氨酸，導致存在賊輕的單純性大皰性表皮松解癥(EBS)?？偟膩碚f，這些結果表明KRT5中的 p.L461P 是該家族中局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的致病突變。

圖 5：L461P 突變的結構模型。黃色虛線表示兩個氨基酸之間的氫鍵并顯示結構之間的差異。(A) LEU-461 和 PRO-461 分別為綠色和紅色。(B) 在野生型 KRT5 中，LEU-461 形成兩個氫鍵（與 MET-457 和 VAL-465）。(C) 突變體 PRO-461 僅形成一個氫鍵（與 VAL-465）。

檢索報告的 KRT5 突變和分析

為了研究 KRT5 突變是否存在任何富含突變的外顯子，我們檢索了 KRT5 中所有報告的突變。如圖所示表格1，自 2008 年 1 月 1 日以來，已發(fā)現約 28 個導致 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的新型 KRT5 突變。KRT5 尾部結構域的突變通常與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 游走性環(huán)狀紅斑 (EBS-Migr) 和疾病的色素形式相關，表明該區(qū)域可能在調節(jié)色素沉著和炎癥方面發(fā)揮作用。另外，在基因診斷方面，篩查引起單純性大皰性表皮松解癥(EBS)的突變時，更應注意這些編碼尾區(qū)的外顯子。我們注意到只有少數突變與局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 相關，這些突變分布在 KRT5 的所有區(qū)域，但主要聚集在頭部和非螺旋接頭區(qū)域。^{示例包括 p.Val133Met、p.Asn146Lys、p.Met327Thr、p.Asp328Gly 和我們研究中的新突變 ( p.Leu} 461Pro) 。它表明，如果患者被診斷為局限性 單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，則編碼 KRT5 頭部和非螺旋接頭區(qū)域的序列應該適合突變篩查。由于基因表達過程復雜，易受其他基因和外界因素的影響，因此在預測基因型與表型之間的關系時需謹慎。

表格1：局限性大皰性表皮松解癥的新型KRT5突變

HIP：螺旋起始肽，HTP：螺旋終止肽。

KRT5和KRT14基因編碼表皮基底層和相關復合上皮細胞中的中間絲 (IF) 蛋白。角蛋白中間絲 (KIF) 網絡附著于橋粒和半橋粒，將角質形成細胞連接到相鄰細胞和基底膜，形成細胞間粘附，保護上皮細胞免受機械和其他應力。單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 與KRT5和KRT14的突變密切相關，但突變導致角蛋白網絡形成和崩潰的機制仍不清楚。

據報道，KRT5/KRT14細絲網絡結構的破壞會導致基底角質形成細胞的脆弱性，使細胞無法承受機械壓力，進而導致細胞內出現空泡，賊終導致皮膚起泡。薩萬特等人。發(fā)現蘇氨酸 150 (T150) KRT5 磷酸化在 KIF 網絡的形成中起重要作用，與 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的發(fā)病機制有關。此外，其他病理機制在單純性大皰性表皮松解癥(EBS)的病理生理學中起著重要作用，包括炎癥前細胞因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素-1β（IL-1β）以及與之相關的信號通路。羅素等人。發(fā)現由于機械應力導致ERK和PKB的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）和蛋白激酶B（PKB）信號轉導通道的激活參與了單純性大皰性表皮松解癥(EBS)，導致角蛋白突變細胞在通道激活后對細胞凋亡產生抗性 . 除此之外，疾病的發(fā)生還涉及其他機制，包括機械應力恢復受損、細胞連接元件下調和上皮細胞粘附破壞。到目前為止，我們不知道該突變 (p.L461P) 如何導致該家族的臨床表現；需要進一步的研究來深入了解本研究中發(fā)現的突變的詳細分子發(fā)病機制。

目前，單純性大皰性表皮松解癥(EBS)尚無有效的治療方法；主要治療是對癥處理。例如足底注射肉毒毒素，作為一種安全且持久的方法，可以有效阻止水泡的發(fā)生。此外，據報道長期口服紅霉素可能對EBS-DM有效 。1% 雙醋瑞因軟膏被認為是一種耐受性良好且安全的靶向治療，可顯著減少大多數 EBS-DM 患者的水皰。由于在 EBS-DM 患者的水皰頂部和皮膚液體中發(fā)現 Th17 細胞因子過度表達，在使用抗 IL-17 藥物治療后，觀察到所有患者的水皰數量急劇減少. 西蘭花產生的天然化學物質蘿卜硫素已被證明可以通過誘導表皮基底層中 KRT16 和 KRT17 的表達并改善 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 表型來治療 KRT14 缺陷小鼠的水皰。賊近，北京等人。成功開發(fā)了一種體外基因療法，使用成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列 (CRISPR)/Cas9 來糾正反復性COL7A1異種移植小鼠模型中營養(yǎng)不良性 大皰性表皮松解癥 (EB) 的突變。顯然，在用 RNA 治療 大皰性表皮松解癥 (EB) 方面取得了相當大的進展，但也存在局限性。由于它是一種遺傳疾病，基因組編輯作為賊先進的基因治療方法可以用于臨床治療。具體而言，由于KRT5基因中的突變?yōu)?c.1382T>C，因此可以使用胞苷堿基編輯器對其進行校正，從而實現 C 到 T 的轉換。

總之，這是一項報告 KRT5 的研究：2B 螺旋處的 p.L461P 錯義突變，或 KRT5 密碼子 461 中的任何突變。鑒定 KRT5 中的這種新突變 (p.L461P) 將有助于更好地了解局部 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 的潛在病理生理學基礎，可用于基因診斷、遺傳咨詢和基因治療。此外，它還可以更深入地了解 單純性大皰性表皮松解癥(EBS) 中的表型-基因型相關性。