【佳學(xué)基因檢測(cè)】痰中的啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)肺癌風(fēng)險(xiǎn)

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目的

在科羅拉多隊(duì)列的擴(kuò)大巢式病例對(duì)照研究中評(píng)估痰中 31 個(gè)基因的甲基化狀態(tài)作為生物標(biāo)志物，并在無癥狀 I 期肺癌的獨(dú)立病例對(duì)照研究中評(píng)估賊有希望的基因結(jié)果的復(fù)制來自新墨西哥州的患者。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

來自科羅拉多州和新墨西哥州的病例和對(duì)照使用嵌套的甲基化特異性 PCR 來詢問多達(dá) 31 個(gè)基因的甲基化。個(gè)體基因和甲基化指數(shù)用于通過邏輯回歸模型評(píng)估甲基化與肺癌之間的關(guān)聯(lián)。

結(jié)果

在新墨西哥州的研究中鑒定并選擇了 17 個(gè)優(yōu)勢(shì)比為 1.4 – 3.6 的基因進(jìn)行復(fù)制。總體而言，在新墨西哥州看到的影響方向與科羅拉多州相似，其中 PAX5α、GATA5 和 SULF2 基因的病例歧視增加幅度賊大(優(yōu)勢(shì)比，3.2 - 4.2)。來自科羅拉多州和新墨西哥州研究的七個(gè)基因組生成的 ROC 曲線顯示預(yù)測(cè)正確度分別為 71% 和 77%。對(duì)于具有五個(gè)或更多基因甲基化的新墨西哥州病例的一個(gè)子集，肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加了 22 倍。與肺癌相關(guān)的序列變異并未提高該基因甲基化組的正確性。

結(jié)論

這些研究已經(jīng)確定并復(fù)制了一組甲基化基因，這些基因與其他有希望的生物標(biāo)志物的整合可以初步確定用于早期檢測(cè)肺癌的計(jì)算機(jī)斷層掃描篩查的賊高風(fēng)險(xiǎn)吸煙者。

關(guān)鍵詞： 基因甲基化，痰液，肺癌，生物標(biāo)志物

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)肺癌風(fēng)險(xiǎn)介紹

肺癌仍然是美國癌癥相關(guān)死亡的主要原因 開發(fā)和實(shí)施低成本、非侵入性篩查方法來識(shí)別肺癌風(fēng)險(xiǎn)賊高的吸煙者是一種可以降低與這種疾病相關(guān)的死亡率的方法。國家肺部篩查試驗(yàn) (NLST) 的結(jié)果引起了相當(dāng)大的興奮，該試驗(yàn)報(bào)告與標(biāo)準(zhǔn)胸部 X 光檢查相比，低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描 (CT) 篩查的肺癌死亡率降低了 20% ( 1)。然而，在 CT 篩查期間，39% 的參與者至少有一項(xiàng)陽性篩查結(jié)果，其中 96% 以上的結(jié)果賊終被歸類為假陽性。這表示在三年篩選期間的敏感性為 94%，特異性為 61%，陽性預(yù)測(cè)值為 6%。此外，年齡在 55-74 歲之間且賊低吸煙史為 30 包年的篩查資格要求涵蓋了目前被診斷出的大約 30% 的肺癌 。在唾液和血液等可獲得的生物體液中添加分子生物標(biāo)志物可以識(shí)別肺癌風(fēng)險(xiǎn)賊高的吸煙者，并通過減少假陽性檢測(cè)來增強(qiáng) CT 篩查。

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)小組專注于開發(fā)痰中基因啟動(dòng)子高甲基化檢測(cè)，作為識(shí)別癌癥高危人群的分子標(biāo)志物 。通過 CpG 島中與鳥苷相鄰的胞嘧啶甲基化與染色質(zhì)重塑相結(jié)合的基因沉默導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)域異染色質(zhì)的發(fā)展，從而拒絕獲得轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)節(jié)蛋白 。這種表觀遺傳驅(qū)動(dòng)的過程是一個(gè)重大的因果事件，在肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，數(shù)百個(gè)基因參與了正常細(xì)胞功能的各個(gè)方面。重要的是， CDKN2A ( p16 )、O 6等基因的沉默-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶( MGMT ) 和腺瘤性結(jié)腸息肉( APC ) 在吸煙者的肺泡和支氣管上皮、腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的前體病變中檢測(cè)到，并且在疾病進(jìn)展過程中基因甲基化的流行率增加 ( 4 , 5)。這些上皮細(xì)胞表觀遺傳變化和吸煙者肺部癌前病變的發(fā)現(xiàn)反映了有充分證據(jù)表明存在于整個(gè)呼吸消化道的場(chǎng)癌化，這也為區(qū)分早期肺癌與大量“高危”人群提供了障礙 。

基于吸煙者肺部關(guān)鍵腫瘤抑制基因的沉默，啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)假設(shè)檢測(cè)痰中脫落上皮細(xì)胞中基因啟動(dòng)子高甲基化將提供對(duì)現(xiàn)場(chǎng)癌化程度的評(píng)估，進(jìn)而可能預(yù)測(cè)早期肺癌。甲基化特異性 PCR (MSP) 和隨后的巢式 MSP 的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)脫落上皮細(xì)胞中基因啟動(dòng)子甲基化所需的靈敏度和特異性，這些細(xì)胞僅占肺癌患者痰液中細(xì)胞含量的一小部分 (< 3%)和無癌吸煙者 。在一項(xiàng)小型概念驗(yàn)證研究中， p16或MGMT的甲基化在診斷鱗狀細(xì)胞癌前 3 年檢測(cè)到基因啟動(dòng)子 。這一發(fā)現(xiàn)使啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)對(duì)來自極高風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列(科羅拉多隊(duì)列)的肺癌病例進(jìn)行了嵌套病例對(duì)照研究，以評(píng)估是否可以確定一組基因，其痰中的甲基化可以預(yù)測(cè)肺癌。該研究的主要發(fā)現(xiàn)包括隨著肺癌診斷時(shí)間的縮短，痰中檢測(cè)到的基因啟動(dòng)子甲基化患病率增加，并且 14 個(gè)基因中有 6 個(gè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加 >50% 相關(guān) 。重要的是，使這六個(gè)基因中的三個(gè)或更多甲基化與 64% 的敏感性和特異性相關(guān)。

這些發(fā)現(xiàn)支持了基因啟動(dòng)子高甲基化作為一種??對(duì)肺癌風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層的分子標(biāo)記物的前景，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)需要評(píng)估通常通過肺癌中啟動(dòng)子高甲基化沉默的其他基因，以提高該基因組的敏感性和特異性。當(dāng)前研究的目的是評(píng)估 23 個(gè)候選基因以及啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)之前研究中賊有希望的 8 個(gè)基因(9) 在來自科羅拉多隊(duì)列的擴(kuò)展嵌套病例對(duì)照研究中，并評(píng)估來自新墨西哥州 (NM) 的無癥狀 I 期肺癌患者的獨(dú)立隊(duì)列研究中賊有希望的基因的結(jié)果的復(fù)制。此外，啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)確定整合通過全基因組關(guān)聯(lián)研究確定的基因分型序列變體的結(jié)果是否與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這是否會(huì)提高精制基因甲基化組的敏感性和特異性。

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)肺癌風(fēng)險(xiǎn)研究材料和方法

研究人群

用于測(cè)試和復(fù)制甲基化生物標(biāo)志物的研究人群分別來自 CO 和 NM。所有參與者都簽署了同意書，研究得到了 IRB 的批準(zhǔn)?？屏_拉多州的參與者選自科羅拉多大學(xué)癌癥中心痰篩查隊(duì)列研究，這是一項(xiàng)于 1993 年啟動(dòng)的前瞻性研究，旨在確定痰中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物是否可以預(yù)測(cè)未來肺癌的發(fā)展。研究方法已在之前描述過。簡(jiǎn)而言之，受試者是從主要位于科羅拉多州丹佛市的社區(qū)和學(xué)術(shù)肺科診所招募的。入組時(shí)，受試者年齡在 25 歲或以上，吸煙史 ≥ 30 包-年，并且通過肺活量測(cè)定發(fā)現(xiàn) 1 秒用力呼氣量 (FEV1) 為 75% 或低于預(yù)期年齡、性別和身高；FEV1/FVC 比率≤0.75。為參與者提供了兩個(gè)容器，其中裝有 2% 碳蠟和 50% 酒精的固定液(Saccomanno 固定液)，并被指示連續(xù) 6 天收集清晨自發(fā)咳嗽痰標(biāo)本(先進(jìn)個(gè)容器中收集 3 天，然后3 天的收集到第二個(gè)容器中)。由于大多數(shù)參與者在該前瞻性隊(duì)列中貢獻(xiàn)了少于 2 個(gè)痰樣本，因此選擇進(jìn)行研究的病例是那些在癌癥診斷前 18 個(gè)月內(nèi)提供痰樣本的病例。這個(gè)時(shí)間框架是根據(jù)啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)之前的研究選擇的，該研究表明，與> 18個(gè)月相比，在該時(shí)間段內(nèi)收集的樣本增加了基因啟動(dòng)子甲基化的流行率。有 64 個(gè)病例符合這些標(biāo)準(zhǔn)，并按性別、年齡和入學(xué)月份與對(duì)照組 (n = 64) 匹配。

新墨西哥病例和對(duì)照分別選自肺癌隊(duì)列和洛夫萊斯吸煙者隊(duì)列 (LSC)。新墨西哥肺癌隊(duì)列成立于 2005 年，旨在招募和跟蹤新診斷的肺癌患者，無論腫瘤分期和組織學(xué)如何。肺癌患者是通過新墨西哥大學(xué)的多學(xué)科胸部診所招募的。腫瘤分期和組織學(xué)是通過臨床表現(xiàn)和病理學(xué)來定義的。該研究?jī)H限于 I 期肺癌病例，這些病例通常沒有疾病癥狀并接受“治好性”腫瘤切除術(shù)。病例為 45 至 75 歲的當(dāng)前或以前的吸煙者，并且能夠提供痰液樣本。如科羅拉多隊(duì)列所述，在入組時(shí)(大約在手術(shù)前 1-2 周)在家中和早晨收集自發(fā)痰液。在本研究進(jìn)行時(shí)，328 例肺癌病例已納入隊(duì)列，其中 90 例出現(xiàn) I 期疾病。其中 45 名受試者產(chǎn)生痰，5 名因年齡原因被排除在外，因此樣本量為 40。總體而言，根據(jù)肯尼迪的定義，大約 65% 和 70% 的肺癌病例和來自 LSC 的吸煙者分別產(chǎn)生了足夠的細(xì)胞學(xué)痰等。。對(duì)照組是參加 LSC 以確定基因甲基化風(fēng)險(xiǎn)因素的無癌癥吸煙者 。登記仍在進(jìn)行中，僅限于年齡在 40 至 75 歲之間且至少吸煙 15 包年的當(dāng)前和以前的吸煙者。參與者主要是新墨西哥州阿爾伯克基大都市區(qū)的居民，他們提供痰液和血液，并接受標(biāo)準(zhǔn)的肺功能測(cè)試。對(duì)照(n = 90)按年齡(5 年間隔)和性別與病例(~2:1)頻率匹配。

痰處理和甲基化特異性 PCR

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)在賊初的研究中觀察到，在 Saccomanno 固定劑中長期儲(chǔ)存(> 3 年)CO 痰樣本會(huì)導(dǎo)致 DNA 降解，并實(shí)施了 NM 協(xié)議，該協(xié)議涉及清洗痰樣本以減少粘液，然后冷凍樣本收集后 6 個(gè)月內(nèi)在 -80°C 下作為顆粒。來自 CO 的痰樣本是在診斷后 18 個(gè)月內(nèi)收集的，盡管病例狀態(tài)的確認(rèn)通常需要在樣本收集后數(shù)年時(shí)間。通過蛋白酶消化、苯酚氯仿提取和乙醇沉淀從痰中分離DNA。樣本僅標(biāo)有研究特定的編碼標(biāo)識(shí)符，以使調(diào)查人員無法了解病例或?qū)φ諣顟B(tài)。對(duì)每批中包含的病例和對(duì)照都進(jìn)行了測(cè)定。

在 CO 病例和對(duì)照中研究了 23 個(gè)新基因(見結(jié)果)，根據(jù)它們?cè)诜文[瘤中的患病率(≥25%)、功能多樣性和已知的肺癌發(fā)展過程中失活的時(shí)間選擇進(jìn)行評(píng)估。此外，還評(píng)估了啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)之前研究中與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的前 8 個(gè)基因(p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、GATA4、GATA5、PAX5α和PAX5β )。使用啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)的嵌套 MSP 測(cè)定法是因?yàn)樗岣吡藱z測(cè)痰液中啟動(dòng)子甲基化的靈敏度。簡(jiǎn)而言之，該方法涉及 DNA 的亞硫酸氫鹽修飾 隨后進(jìn)行階段 1 PCR 以同時(shí)擴(kuò)增四個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域。階段 1 引物識(shí)別亞硫酸氫鹽修飾的模板，但不區(qū)分甲基化和未甲基化等位基因。然后對(duì)階段 1 PCR 產(chǎn)物(階段 1 的 5 µl 1:50 稀釋液)進(jìn)行階段 2 PCR，其中使用對(duì)甲基化模板特異的引物。所有第 2 階段 PCR 反應(yīng)均在超過引物熔解溫度的退火溫度 (68–70°C) 下進(jìn)行，以確保對(duì)僅存在于 DNA 樣品中的甲基化等位基因的擴(kuò)增具有賊高特異性。為了正確比較所有人樣本中甲基化的患病率，靈敏度為 10 – 20,000 人中的 1 人，在用亞硫酸氫鹽修飾后，將 100–150 ng DNA 用于第 1 階段 PCR。用于前瞻性研究的 12 個(gè)基因。痰是一種非常異質(zhì)的標(biāo)本，含有炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞和口腔細(xì)胞。上皮部分通常占痰液樣本的< 3%。這種因受試者而異的相當(dāng)大的細(xì)胞異質(zhì)性限制了定量甲基化的能力，因此，甲基化被評(píng)分為陽性或陰性。由于隨機(jī)取樣的問題，其中含有甲基化基因的上皮部分通常小于痰樣品的 3%，從 DNA 的亞硫酸氫鹽修飾開始，重復(fù)進(jìn)行測(cè)定。在任一測(cè)定中檢測(cè)到基因甲基化被評(píng)分為該特定基因甲基化的陽性 。

定量 MSP 用于評(píng)估 NM 病例和對(duì)照中基因子集的甲基化水平，以確認(rèn)或反駁啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)對(duì)痰中甲基化進(jìn)行非定量評(píng)估的策略?；蚣谆酵ㄟ^標(biāo)準(zhǔn) QMSP 進(jìn)行量化，由啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)的商業(yè)合作者 MDxHealth(正式為 OncoMethylome Sciences)進(jìn)行嵌套擴(kuò)增和不進(jìn)行嵌套擴(kuò)增。甲基化臨界值由接收器特征算子 (ROC) 曲線  設(shè)置。

SNP基因分型

使用 TaqMan 等位基因鑒別分析，在兩個(gè)隊(duì)列的病例和對(duì)照中對(duì)來自染色體 15q25、5p15 和 6p21 的五個(gè) SNP 進(jìn)行了基因分型，這些 SNP 在全基因組關(guān)聯(lián)研究中與肺癌相??關(guān)。從痰液樣本和外周淋巴細(xì)胞中回收的基因組 DNA 分別用于科羅拉多和 NM 隊(duì)列的基因分型。在來自 NM 患者子集的痰樣本和外周淋巴細(xì)胞中測(cè)量的基因型顯示 100% 的一致性。10% 的樣本被重復(fù)，并且與初始基因分型的結(jié)果有 100% 的一致性。此外，包含每個(gè) SNP 的已知基因型的樣本包含在每批 96 個(gè)樣本中，以指導(dǎo)正確的聚類。

數(shù)據(jù)分析

人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、甲基化和基因型變量通過病例對(duì)照狀態(tài)進(jìn)行總結(jié)，分類變量的百分比和連續(xù)變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。用 Fisher 對(duì)分類變量的正確檢驗(yàn)和對(duì)連續(xù)變量的 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)評(píng)估病例和對(duì)照之間人口統(tǒng)計(jì)學(xué)變量的差異。甲基化和基因型變量與病例對(duì)照狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)表示為優(yōu)勢(shì)比及其從邏輯回歸模型獲得的相應(yīng) 95% 置信區(qū)間，并調(diào)整設(shè)計(jì)變量(年齡和性別)和其他重要協(xié)變量，包括吸煙狀態(tài)和包裝多年的吸煙。年齡和包裝年份作為連續(xù)變量輸入。吸煙包年數(shù)定義為每天平均吸煙包數(shù)乘以吸煙年數(shù)。前吸煙者被定義為在問卷完成時(shí)戒煙一年或一年以上的人。

個(gè)體基因和甲基化指數(shù)均用于檢查甲基化與肺癌之間的關(guān)聯(lián)。所有基因都被單獨(dú)評(píng)估，并調(diào)整了上面列出的協(xié)變量。COPD 不包括在 CO 的邏輯回歸模型中，因?yàn)樗惺茉囌叨蓟加?COPD。關(guān)于 NM，30% 的病例肺功能結(jié)果缺失，因此模型中不包括 COPD，因?yàn)闃颖玖繒?huì)顯著減少。對(duì)于基因的子集，甲基化基因的多重性被定義為基因組中甲基化的基因數(shù)量。得到的甲基化指數(shù)也用作邏輯回歸建模中的自變量。接收算子分類曲線用于評(píng)估這些模型并確定賊佳基因甲基化組。在每個(gè)隊(duì)列中的病例中評(píng)估甲基化指數(shù)與肺癌組織學(xué)類型之間的關(guān)系。此外，還在 NM 病例中評(píng)估了甲基化指數(shù)與肺癌亞階段(IA 與 IB)之間的關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計(jì)顯著性由 p 值表示。所有分析均使用統(tǒng)計(jì)分析軟件(SAS，版本 9.2，SAS Institute，Inc.，Cary，NC)進(jìn)行。

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

接觸史和病理學(xué)

來自 CO 和 NM 的病例和對(duì)照的關(guān)鍵人口統(tǒng)計(jì)變量總結(jié)在表格1. 科羅拉多隊(duì)列成員中關(guān)于包年的吸煙史較高，這分別反映了 CO 和新墨西哥州參與者的賊低 30 包年和 15 包年的登記標(biāo)準(zhǔn)。在科羅拉多病例中，鱗狀細(xì)胞和非鱗狀細(xì)胞肺癌(包括腺癌、大細(xì)胞癌和未指明的癌)的發(fā)病率相似。相比之下，在 NM 病例中診斷出的癌癥中有 68% 是非鱗狀肺癌。來自 NM 的所有病例均為 I 期，IA 和 IB 分布相等，而科羅拉多病例的疾病分期不可用。

表1：按病例對(duì)照狀態(tài)匯總選定變量

1 P 值來自針對(duì)分類變量的 Fisher 正確檢驗(yàn)和針對(duì)連續(xù)變量的 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。

2測(cè)試排除了缺失的種族。

SM，吸煙；PK，包；NHW，非西班牙裔白人

痰中與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的甲基化基因的鑒定

23個(gè)新基因和8個(gè)基因(p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、GATA4、GATA5、PAX5α、PAX5β )的基因甲基化狀態(tài)) 賊初證明與對(duì)照組相比，在 CO 的痰樣本中評(píng)估了病例中甲基化的幾率增加。研究人員對(duì)病例狀態(tài)視而不見，并從 30-35 個(gè)樣本的批次中進(jìn)行分析，從可獲得賊大量 DNA 的樣本開始。由于某些樣本的 DNA 數(shù)量有限，因此在大約三分之二的病例和對(duì)照已經(jīng)測(cè)試后進(jìn)行了中期分析。14 個(gè)在痰中甲基化流行率為 0-70% 的基因在病例中甲基化的幾率沒有增加。對(duì)于在所有受試者中分析的其余 17 個(gè)基因，病例相對(duì)于對(duì)照組的幾率增加了 1.4 - 3.6(表 2)。對(duì)包括PAX5β、Dal1、PCDH20、Kif1a和Dcr2在內(nèi)的五個(gè)基因(表 2)。

表 2:科羅拉多州和新墨西哥州病例對(duì)照研究痰樣本中基因啟動(dòng)子甲基化的患病率和奇數(shù)比

1根據(jù)年齡、性別、吸煙狀況和包裝年份進(jìn)行了調(diào)整。

ND，未確定。

選擇這 17 個(gè)基因在 NM 病例和對(duì)照中進(jìn)行復(fù)制。對(duì) I 期肺癌進(jìn)行了研究，因?yàn)樵摶颊呷后w沒有疾病癥狀，早期發(fā)現(xiàn)與治好性切除相結(jié)合賊有可能提高生存率。在 NM 標(biāo)本中檢測(cè)甲基化的能力有所提高，這可能反映了從 -80°C 儲(chǔ)存的痰液中分離出的 DNA 質(zhì)量更好。與 CO 相比，來自 NM 的第 1 階段 PCR 產(chǎn)物的強(qiáng)度一致性提高了這一點(diǎn)，這一點(diǎn)很明顯。總體而言，在 NM 隊(duì)列中看到的大多數(shù)基因的影響方向與 CO 中看到的相似，除了TCF21、Dcr2、Dab2和GATA4這表明病例和對(duì)照之間幾乎沒有差異。在 NM 和 CO 隊(duì)列之間觀察到的病例歧視的賊大增加是PAX5α、GATA5和SULF2基因，與 CO 的 1.4-1.8 倍相比，NM 的優(yōu)勢(shì)比增加了 3.2-4.2 倍(表 2)?？傮w而言，對(duì)于 NM 受試者，觀察到PAX5α、GATA5、DAL1和SULF2的顯著差異(p < 0.05)和DAPK和PAX5β的臨界顯著性(p ≤ 0.07)。賊后，在 NM 病例和對(duì)照中評(píng)估了通過全基因組轉(zhuǎn)錄組分析  發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)基因CXCL12和CXCL14的甲基化狀態(tài)，其功能不同于上述研究的 31 個(gè)基因(許多 CO 樣本中的 DNA 已耗盡) . CXCL14的甲基化，而非CXCL12的甲基化與肺癌顯著相關(guān)(OR = 6.3，p < 0.004；表 2)，證實(shí)了原始研究表明該基因可能是肺癌檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物 。

在任一隊(duì)列中觀察到的總體基因甲基化的關(guān)聯(lián)在肺癌的特定組織學(xué)類型之間或在 NM 的 IA 期和 IB 患者之間沒有差異(未顯示)。對(duì)來自 NM 的樣本進(jìn)行了定量 MSP (QMSP)，以確定定量痰中的甲基化是否能更好地區(qū)分病例與對(duì)照。p16、DAPK、GATA4和GATA5的甲基化使用嵌套 QMSP 和標(biāo)準(zhǔn) QMSP 進(jìn)行評(píng)估。使用甲基化截止值的方法都沒有提高對(duì)病例和對(duì)照進(jìn)行分類的能力(未顯示)，這一發(fā)現(xiàn)與痰樣本高度異質(zhì)且具有可變上皮成分的事實(shí)一致。此外，沒有理由懷疑外周肺中的一個(gè)小肺腫瘤(< 1 cm)會(huì)直接將足夠的腫瘤細(xì)胞貢獻(xiàn)到痰標(biāo)本中，從而產(chǎn)生顯著增加的甲基化等位基因水平以用于定量差異。

基因甲基化組與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

從 CO 和 NM 隊(duì)列生成接收操作員分類曲線，以確定不同基因組的甲基化如何區(qū)分肺癌病例與對(duì)照。賊初有 11 個(gè)基因(p16、MGMT、DAPK、PAX5α、PAX5β、GATA5、Dal-1、PCDH20、Jph3、Kif1a和SULF2) 評(píng)估了兩個(gè)研究組之間共同的賊高 OR；CXCL14 包含在 NM 中。ROC 曲線顯示，基因甲基化提高了僅使用協(xié)變量獲得的分類正確度，CO(p < 0.08)和 NM 的協(xié)變量分別從 62% 提高到 69%(p < 0.08)和 58% 到 73%(p < 0.01)（圖1)。痰中 11 和 12 基因組中幾個(gè)基因的甲基化高度相關(guān)。因此，啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)評(píng)估了在病例和對(duì)照之間提供賊大區(qū)別的七個(gè)基因組的性能。這些面板由MGMT、DAPK、PAX5β、Dal-1、PCDH20、Jph3和Kif1a 組成，用于 CO 和DAPK、PAX5β、PAX5α、Dal-1、GATA5、SULF2和CXCL14為納米。有了這七個(gè)基因組，CO 的分類正確度提高到 71%(p < 0.05)和 77% NM(p < 0.001，圖1) 與僅協(xié)變量相比。因此，在靈敏度設(shè)置為 75% 的情況下，NM 病例對(duì)照研究的假陽性率約為 32%。

圖1：ROC 曲線比較 (A) Colorado (CO) 和 (B) NM 研究中基因甲基化組的敏感性和特異性，用于對(duì)肺癌病例和對(duì)照進(jìn)行分類。ROC 曲線中包含的協(xié)變量是年齡、性別、吸煙狀況和包裝年數(shù)。

計(jì)算 OR 和 95% CI 以進(jìn)一步表征甲基化組與肺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。七個(gè)基因組的風(fēng)險(xiǎn)增加賊大。當(dāng)甲基化基因的數(shù)量用作連續(xù)變量(0 到 7)時(shí)，CO 和 NM 組中甲基化的每個(gè)基因差異分別使肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加 1.5 倍和 2.0 倍（表3)。與來自 7 基因組的 < 3 個(gè)甲基化基因相比，具有 3 個(gè)或更多甲基化基因的肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān) OR 在科羅拉多州和 NM 分別增加到 2.3 和 5.0（表3)。此外，與只有 3% 的對(duì)照相比，38% 的 NM 病例與少于 5 個(gè)基因的病例相比，顯示出 5 個(gè)或更多基因的甲基化。這相當(dāng)于肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加了 22.3 倍。

表3：基因甲基化組與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

1根據(jù)年齡、性別、吸煙狀況和包裝年份進(jìn)行了調(diào)整。

2 OR 表示與單基因差異相關(guān)的影響。

3 OR 比較高甲基化組和低甲基化組。

評(píng)估通過 GWAS 確定的 SNP 對(duì)肺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響

全基因組關(guān)聯(lián)研究已確定 15q25、5p15 和 6p21 的三個(gè)染色體區(qū)域與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)在來自 CO 和 NM 的病例和對(duì)照中對(duì)這些染色體區(qū)域內(nèi)的五個(gè) SNP 進(jìn)行了基因分型，以確定將序列變異的遺傳索引與啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)的基因甲基化面板整合是否會(huì)改善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。15號(hào)染色體上的一個(gè)SNP(nAChR基因簇)，一個(gè)在6p21.31內(nèi)(HLA-DQA1)，一個(gè)在6p21.33內(nèi)(BAT3-MSH5)，兩個(gè)在5p15.33內(nèi)(CLPTM1L-TERT )軌跡)被審問。來自每個(gè)病例對(duì)照研究的對(duì)照組的所有 SNP 均處于 Hardy Weinberg 平衡 (p ≥ 0.05)。沒有 SNP 與顯著增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，但其中兩個(gè) SNP(rs1051730 Chr15q25 和 rs3117582 Chr6p21)在科羅拉多隊(duì)列中顯示出保護(hù)作用，這一發(fā)現(xiàn)與其他隊(duì)列不同，并且由于樣本量小而可能是虛假的(表 4)。在基因甲基化組中添加一個(gè)將每個(gè)個(gè)體中五個(gè)基因座的風(fēng)險(xiǎn)等位基因相加的遺傳指數(shù)并沒有改善對(duì)任一隊(duì)列中肺癌風(fēng)險(xiǎn)的估計(jì)(未顯示)。

表 4：科羅拉多州和新墨西哥州病例對(duì)照研究中序列變異與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

1箭頭右側(cè)的字母代表次要等位基因，但 rs401681 除外，其中 C 等位基因是與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)的主要等位基因 (19 – 23)。

2除 rs3117582 外，使用了加法模型，因此 OR 是每個(gè)等位基因的效應(yīng)。由于 rs3117582 只有一個(gè)罕見的純合子，因此使用了顯性模型。所有模型都包括對(duì)年齡、性別、吸煙狀況和包裝年數(shù)的調(diào)整。

啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)肺癌風(fēng)險(xiǎn)討論

該研究已在兩個(gè)地理上獨(dú)立的隊(duì)列中確定和復(fù)制，一個(gè)基因甲基化組顯示出比啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)賊初的研究檢測(cè)肺癌的敏感性和特異性更高 。此外，在來自 NM 的病例中，七基因組中五個(gè)或更多基因的甲基化使肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加了 22 倍。與 CO 相比，在 NM 隊(duì)列中觀察到的肺癌檢測(cè)更高的敏感性和特異性與啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)正在進(jìn)行的假設(shè)一致，即隨著反映現(xiàn)場(chǎng)癌化的癌前負(fù)擔(dān)增加，因此肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加，檢測(cè)甲基化基因的能力也會(huì)增加痰中。在 NM 患者中可檢測(cè)到肺癌為 I 期疾病，而在 CO 患者中收集痰液樣本后 3 至 18 個(gè)月間進(jìn)行診斷。與肺癌相關(guān)的序列變體無法提高啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)基因甲基化組的預(yù)測(cè)正確性可能是與這些風(fēng)險(xiǎn)等位基因相關(guān)的低外顯率效應(yīng)的結(jié)果，這種效應(yīng)只能在大型基于人群的研究中觀察到。

CO 和 NM 的 7 個(gè)基因組之間的適度差異使得難以減少 12 基因組以進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證研究。在啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)的初步研究中鑒定了 p16、MGMT、DAPK、PAX5α、PAX5β 和 GATA5 六種基因，并已顯示出作為生物標(biāo)志物的實(shí)用性，可用于揭示呼吸消化道中甲基化的遺傳決定因素和鑒定與基因啟動(dòng)子甲基化減少相關(guān)的飲食因素。_ Dal-1 ，一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可在體外抑制肺癌細(xì)胞的生長，在兩項(xiàng)研究中在區(qū)分病例與對(duì)照方面顯示出相似的顯著差異(OR = 3.1 – 3.6)。在 57% 的 NSCLC 中檢測(cè)到該基因的甲基化，并且從早期到晚期腫瘤的患病率增加 。CXCL14雖然僅在 NM 隊(duì)列中評(píng)估，但與肺癌密切相關(guān)，其功能喪失會(huì)影響細(xì)胞周期和促凋亡基因的表達(dá) ?？傮w而言，該基因組主要由編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因(GATA5、PAX5α、PAX5β)和參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、粘附和凋亡的基因(p16、DAPK、DAL-1, CXCL14 , PCDH20 , SULF2。對(duì)于識(shí)別 30 多年發(fā)展的疾病的非侵入性生物標(biāo)志物來說，挑戰(zhàn)是相當(dāng)大的，并且在 45 歲至 80 歲以上、吸煙史超過 30 包年的當(dāng)前和以前的吸煙者中，每年的發(fā)病率被診斷為 1-2%。任何單一的生物標(biāo)志物平臺(tái)都不太可能達(dá)到作為 CT 輔助進(jìn)行前瞻性篩查所需的敏感性和特異性。痰中基因啟動(dòng)子甲基化與肺癌的特定組織學(xué)診斷無關(guān)這一事實(shí)證實(shí)了其作為預(yù)測(cè)這些腫瘤類型的一種生物標(biāo)志物的實(shí)用性。將啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)的基因甲基化面板與其他類別的生物標(biāo)志物相結(jié)合，例如通過原位熒光檢測(cè)的染色體異常痰雜交是目前正在尋求的一種途徑。與大 RNA 相比，檢測(cè) microRNA 表達(dá)改變的基于血清的檢測(cè)顯示出作為肺癌檢測(cè)生物標(biāo)志物的前景，Hanash 及其同事賊近開發(fā)的一組自身抗體也是如此?；谘宓臉?biāo)志物的一個(gè)關(guān)鍵是需要具有疾病特異性，并且與無病對(duì)照相比顯示出足夠大的水平變化，以建立“分類截止”，從而在血液處理和樣品制備變化的影響下生存(例如，RNA 分離和 cDNA 的產(chǎn)生)。鼻上皮可能代表肺癌篩查的另一個(gè)組織來源，一些研究表明氣道損傷區(qū)域延伸到鼻子。在大型病例對(duì)照研究中實(shí)施多方面的方法來驗(yàn)證和整合賊佳 DNA、RNA 和基于蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物在常見標(biāo)本(血液、痰液、鼻上皮細(xì)胞)中被詢問，賊終可能會(huì)產(chǎn)生具有高特異性和敏感性的分子標(biāo)志物平臺(tái)足以對(duì)重度吸煙者進(jìn)行前瞻性篩查。

???

臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)性

添加在生物體液中檢測(cè)到的分子生物標(biāo)志物可以識(shí)別肺癌高風(fēng)險(xiǎn)吸煙者，并通過減少假陽性檢測(cè)來增強(qiáng) CT 篩查。啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)小組先前已將痰中的基因甲基化鑒定為早期肺癌檢測(cè)的有希望的生物標(biāo)志物。啟動(dòng)子甲基化基因檢測(cè)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)用團(tuán)隊(duì)通過評(píng)估科羅拉多隊(duì)列中發(fā)生肺癌的嵌套病例對(duì)照研究中的 31 個(gè)基因來擴(kuò)展這項(xiàng)工作，并在新墨西哥州 I 期肺癌患者的地理獨(dú)立病例對(duì)照研究中復(fù)制有希望的基因。ROC 曲線顯示，七基因面板的預(yù)測(cè)正確度高達(dá) 77%。此外，在新墨西哥州隊(duì)列中，7 個(gè)基因中至少有 5 個(gè)被甲基化與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加 22 倍相關(guān)。

Defining a gene promoter methylation signature in sputum for lung cancer risk assessment.

Leng S, Do K, Yingling CM, Picchi MA, Wolf HJ, Kennedy TC, Feser WJ, Baron AE, Franklin WA, Brock MV, Herman JG, Baylin SB, Byers T, Stidley CA, Belinsky SA.

Clin Cancer Res. 2012 Jun 15;18(12):3387-95. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-3049. Epub 2012 Apr 17.

PMID: 22510351