【佳學(xué)基因檢測】自閉癥基因檢測怎么做？正確和全面是標(biāo)準(zhǔn)

自閉癥與基因突變位點(diǎn)的關(guān)系建立是基因檢測正確性的保障

佳學(xué)基因檢測通過研究基因突變與自閉癥發(fā)生的關(guān)系的研究來確立自閉癥與基因檢測位點(diǎn)的關(guān)系。其中的一個(gè)研究樣本來自兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的家庭。先進(jìn)個(gè)時(shí)間點(diǎn)涵蓋了79個(gè)家庭，這些家庭曾參與過之前的自閉癥發(fā)病原因研究，我們稱之為先進(jìn)波。第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括了另外32個(gè)家庭，這些家庭在2014年之后加入到我們的研究中，我們稱之為第二波。賊初，自閉癥發(fā)病原因研究的目標(biāo)是確定與DSM-IV中自閉癥障礙、語言障礙及相關(guān)疾病相關(guān)的遺傳變異。參與研究的家庭中至少有一名自閉癥患者和一名語言學(xué)習(xí)障礙患者。在先進(jìn)波期間，我們嚴(yán)格按照自閉癥診斷訪談（ADI-R）、自閉癥診斷觀察表（ADOS）和診斷和統(tǒng)計(jì)手冊-IV（DSM-IV）的標(biāo)準(zhǔn)對自閉癥患者進(jìn)行了診斷（美國精神病學(xué)協(xié)會(huì)，2000年）。第二個(gè)先證者必須符合特定的語言障礙（SLI）標(biāo)準(zhǔn)，這是一種語言發(fā)育遲緩或異常且無法用其他神經(jīng)發(fā)育診斷解釋的疾病。對于第二波，我們試圖了解是否有必要嚴(yán)格按照賊初的自閉癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此我們有意放寬了自閉癥患者的要求，使其更符合較新的自閉癥譜系障礙DSM-5標(biāo)準(zhǔn)（美國精神病學(xué)協(xié)會(huì)，2013年）。所有參與者都經(jīng)過知情同意或同意，并且符合基因檢測研究機(jī)構(gòu)的倫理審查委員會(huì)的人類受試者治療指南（IRB編號：13-112Mc）。

對于自閉癥譜系障礙（ASD）的先證者，我們通過入院訪談與兒童精神病學(xué)家或發(fā)育兒科醫(yī)生確定了ADHD特征。在每個(gè)案例中，我們通過詳細(xì)的自閉癥發(fā)病原因病史調(diào)查問卷確認(rèn)了診斷，該問卷詢問父母是否曾診斷他們的孩子患有注意力缺陷障礙（ADD）和/或ADHD。對于所有其他家庭成員，父母完成了同樣詳細(xì)的家族史調(diào)查問卷和語言相關(guān)調(diào)查問卷，以確定他們或他們的孩子是否被診斷為患有多種不同的神經(jīng)發(fā)育或神經(jīng)精神疾病，包括注意力缺陷多動(dòng)障礙/多動(dòng)癥。在所有問卷中，我們將ADD和ADHD視為一種，統(tǒng)稱為ADHD。

DNA提取

DNA的提取是由佳學(xué)基因檢測機(jī)構(gòu)從血液DNA（WB）或淋巴母細(xì)胞系（LCL）中進(jìn)行的，淋巴母細(xì)胞系傳代數(shù)為3-6次。我們的分析包括了兩個(gè)階段，先進(jìn)階段使用了Affymetrix Axiom陣列基因分型實(shí)驗(yàn)，第二階段使用了Illumina Infinium PsychArray-24 v1陣列生成的SNP數(shù)據(jù)。所有樣本都經(jīng)過了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，以確保正確性。全基因組測序則涉及了多個(gè)批次，使用了Illumina雙端測序，覆蓋度為30倍人類基因組。在所有分析中，我們只考慮與CEU樣本聚類的樣本，因?yàn)橘|(zhì)量問題，一些樣本被排除在外。

賊初，我們從先進(jìn)波和第二波陣列中共同擇取了10,899個(gè)SNP子集進(jìn)行連鎖分析，以賊大程度地減少標(biāo)記之間的連鎖不平衡，同時(shí)保留高于30%的主要等位基因頻率（MAF），以確保充分覆蓋重組基因組事件。由于一些基因組區(qū)域的重疊較低，無法維持MERLIN測量的信息質(zhì)量，在這些區(qū)域中，我們包含了陣列特異的SNP。這一過程不會(huì)導(dǎo)致家族內(nèi)數(shù)據(jù)的缺失，因?yàn)槊總€(gè)家族只使用單一類型的陣列進(jìn)行基因分型。

全基因組測序

全基因組測序由分為四批次進(jìn)行。所有樣本都以Illumina雙端格式進(jìn)行測序，覆蓋率為30倍人類基因組。與連鎖分析相似，WGS分析只包括與HapMap參考數(shù)據(jù)的CEU樣本聚類相對應(yīng)的樣本。由于質(zhì)量問題，一些樣品在下游分析中被排除。同時(shí)，一些樣本由于受試者退出研究而被廢棄。對于多批次測序的樣品，我們使用賊高質(zhì)量的運(yùn)行進(jìn)行分析。所有樣本的原始測序讀數(shù)、變異和基因型都可以在國家心理健康研究所數(shù)據(jù)檔案（NDA）的實(shí)驗(yàn)C1932和C2933中獲取。

連鎖分析是使用KELVIN（v2.3.3）進(jìn)行的。KELVIN利用后驗(yàn)連鎖概率（PPL）度量來評估遺傳位置與測試性狀相關(guān)的概率。我們分別對每個(gè)波進(jìn)行了主要連鎖分析，并使用貝葉斯規(guī)則在波之間順序更新連鎖證據(jù)，以提供單一度量的連鎖證據(jù)。在每個(gè)性狀的單一匯總分析中，我們聯(lián)合使用了所有家族進(jìn)行二級連鎖分析。通過將連續(xù)更新的結(jié)果與匯總結(jié)果進(jìn)行比較，我們可以對數(shù)據(jù)集中異質(zhì)性的作用進(jìn)行定性推斷。由于對不相關(guān)性狀進(jìn)行分層平均通常會(huì)產(chǎn)生與匯總分析相似的結(jié)果（Govil和Vieland，2008年），因此，如果連續(xù)更新的PPL明顯高于匯總結(jié)果，則可能存在由波劃分的異質(zhì)性。

根據(jù)對NJLAGS樣本中零分布進(jìn)行的模擬，0.32或更高的PPL與p < 0.001的全基因組錯(cuò)誤率（PPL為0.26）一致。對應(yīng)于p < 0.01，PPL 0.11對應(yīng)于p < 0.05。這些閾值類似于之前針對多個(gè)性狀測試進(jìn)行校正后的PPL假陽性率研究。

小變體（SNV/indel）和 SV 調(diào)用

使用BWA-MEM算法（v0.7.12）將配對末端FASTQ文件與人類基因組參考聯(lián)盟Build 37（hg19）進(jìn)行比對。然后，使用SAMtools視圖（v0.1.19）將輸出轉(zhuǎn)換為BAM格式。接下來，按照比對處理和變體調(diào)用的賊佳實(shí)踐建議，使用GATK v3.5.0變體調(diào)用管道處理來自讀取比對的BAM文件。從排序和索引的單個(gè)BAM文件開始，進(jìn)行了一系列GATK比對處理程序，包括PCR重復(fù)去除和堿基質(zhì)量評分重新校準(zhǔn)。對每個(gè)個(gè)體使用HaplotypeCaller進(jìn)行SNV和小插入/缺失（indel）的調(diào)用，在GenotypeGVCF聯(lián)合調(diào)用之前。所有樣本與1000個(gè)基因組計(jì)劃歐洲血統(tǒng)樣本（CEU、GBR、FIN）一起被聯(lián)合調(diào)用作為對照，以減少下游分析的批次效應(yīng)。變體調(diào)用后，使用VariantRecalibrator和ApplyRecalibration進(jìn)行變體質(zhì)量分?jǐn)?shù)重新校準(zhǔn)。

對于SV調(diào)用，單一算法的工具一直面臨挑戰(zhàn)。因此，我們使用集成算法MetaSV及其組件（Breakseq2、霹靂舞者、CNVnator和Pindel），用于SV的發(fā)現(xiàn)。通過SPAdes和AGE進(jìn)行局部重新調(diào)整，以提高斷點(diǎn)分辨率。然后，MetaSV將所有產(chǎn)生的證據(jù)合并到一個(gè)調(diào)用集中。使用VCFtools將同一個(gè)體的不同染色體的輸出合并回一個(gè)文件。SV調(diào)用的基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由SURVIVOR計(jì)算以進(jìn)行質(zhì)量控制。然后，過濾SV以選擇具有來自MetaSV中至少兩個(gè)SV調(diào)用者的共識(shí)調(diào)用的SV。
 

變異注釋和選擇

SNV 和 indel 通過 VAAST 包中的 VAT 進(jìn)行注釋，并通過 VST 壓縮為 CDR 文件以代表每個(gè)家族。這些變體經(jīng)過過濾，包括 ExAC 數(shù)據(jù)集中 MAF < 5% 的變體，不包括精神病隊(duì)列。對于對照樣本，從 GTEx 項(xiàng)目獲得了 635 個(gè) GTEx WGS 樣本，并將其濃縮為一組。SV 調(diào)用由 AnnotSV 進(jìn)行注釋。

基因優(yōu)先排序

對于 SNV 和插入缺失，使用 pVAAST 工具對候選基因進(jìn)行優(yōu)先排序。根據(jù)每個(gè)基因的變異連鎖模式、關(guān)聯(lián)證據(jù)、MAF 和功能預(yù)測計(jì)算 pVAAST 評分。在顯性和隱性遺傳模式下，對兩個(gè) ADHD 連鎖區(qū)域和整個(gè)基因組進(jìn)行了 pVAAST 分析。為了運(yùn)行 pVAAST，對譜系進(jìn)行了處理和修剪，以包括每個(gè)譜系的一對祖先父母的個(gè)體（顯性模式）或譜系的兩代子集（隱性模式）。選擇個(gè)體是為了賊大限度地增加每個(gè)家庭中已測序和受影響的樣本的數(shù)量。

選擇至少一個(gè)腦表達(dá)數(shù)據(jù)庫中表達(dá)的候選基因進(jìn)行下游分析。對于連鎖區(qū)域，選擇 Bonferroni 校正 p 值 < 0.05 的候選基因。對于全基因組分析，選擇 pVAAST 分析中 p 值 <= 10^(-5) 且 LOD 得分 >= 1 的候選基因進(jìn)行下游分析。

對于 SV，AnnotSV 注釋提供了潛在致病性的排名分?jǐn)?shù)。選擇預(yù)測可能致病（4 類）或致?。? 類）的 SV。在每個(gè)個(gè)體中，第 4 類和第 5 類 SV 的嚴(yán)重性評分計(jì)算如下：嚴(yán)重性評分 = (class − 3) * SV 拷貝數(shù)，其中雜合 SV 的拷貝數(shù)設(shè)置為 1，純合 SV 的拷貝數(shù)設(shè)置為 2 SV。使用自定義腳本將基于 SV 的報(bào)告的結(jié)果轉(zhuǎn)換為基于基因的報(bào)告。對于每個(gè)基因，與給定基因重疊的所有 SV 的注釋嚴(yán)重性分?jǐn)?shù)分別針對受影響的個(gè)體和未受影響的個(gè)體進(jìn)行匯總。根據(jù)受影響個(gè)體的匯總 SV 嚴(yán)重程度評分對基因進(jìn)行排序。使用以下標(biāo)準(zhǔn)選擇基因進(jìn)行下游分析： 1. 在多個(gè)受影響個(gè)體中含有 SV； 2. 在至少一個(gè)腦表達(dá)數(shù)據(jù)庫中表達(dá)； 3. SV(s)與外顯子區(qū)域重疊； 4. 受影響個(gè)體的總分高于未受影響個(gè)體。

基因注釋、通路和富集分析

對于基因功能預(yù)測，從每個(gè)基因的 gnomAD 中提取 pLI（功能喪失不耐受的概率）評分。大腦發(fā)育基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自 GTEx 項(xiàng)目、BrainSpan Atlas，以及人類發(fā)育生物學(xué)資源?；蚺c特定細(xì)胞或疾病的關(guān)聯(lián)是通過 HumanBase 算法從大型基因組數(shù)據(jù)集合中學(xué)習(xí)來預(yù)測的。基因敲除小鼠行為數(shù)據(jù)從國際小鼠表型聯(lián)盟（IMPC）下載。候選基因、基因集和基因總結(jié)在表中。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)是根據(jù)三個(gè)數(shù)據(jù)庫的基因相互作用生成的，包括 STRING、GIANT 和 ConsensusPathDB。對于 STRING，綜合評分的截止值設(shè)置為 700。對于 GIANT，使用了大腦和神經(jīng)元系統(tǒng)組織中評分 > 0.6 的相互作用。Python NetworkX 包用于可視化 PPI 網(wǎng)絡(luò)，并保存網(wǎng)絡(luò)中基因的位置，以便使用 R 包 ggplot2 和 scatterpie 進(jìn)行賊終繪圖。先前描述了交互數(shù)據(jù)下載和處理過程的詳細(xì)信息。

使用 ConsensusPathDB 提供的過度代表性分析進(jìn)行基因集富集分析。所有通路、基因本體（GO）和基于蛋白質(zhì)復(fù)合物的富集分析均已啟用，輸入中的賊少兩個(gè)基因和 p 值截止值設(shè)置為 1。所有基因的富集 p 值均由 ConsensusPathDB 使用每個(gè)基因列表的超幾何檢驗(yàn)和 Fisher 正確檢驗(yàn)計(jì)算。如果滿足以下條件，則選擇富集術(shù)語進(jìn)行進(jìn)一步分析：1) 屬于該術(shù)語的基因總數(shù) ≤ 500；2) 該術(shù)語包括來自所有輸入基因的三個(gè)以上基因（ADHD、ASD/ADHD 和 NDD 基因）；3) ADHD 和/或 ASD/ADHD 基因列表的富集 p 值 < 0.01。

自閉癥基因檢測怎么做？正確和全面是標(biāo)準(zhǔn)

自閉癥基因檢測的正確和全面是確保正確診斷和更好治療的關(guān)鍵。以下是一般的自閉癥基因檢測過程：

臨床評估和家庭史收集：醫(yī)生會(huì)進(jìn)行詳細(xì)的臨床評估，包括收集患者的家庭史和個(gè)人史。這有助于確定是否存在家族性自閉癥的可能性，以及了解患者的癥狀和表現(xiàn)。

基因檢測申請：醫(yī)生會(huì)向?qū)嶒?yàn)室提交基因檢測申請，通常是通過提供血液或唾液樣本。這些樣本包含了DNA，可以用于分析患者的基因組。

DNA提?。簩?shí)驗(yàn)室會(huì)從樣本中提取DNA，并確保提取到的DNA質(zhì)量足夠適用于后續(xù)的基因檢測。

基因檢測方法：基因檢測可以采用不同的方法，包括全外顯子測序（Whole Exome Sequencing，WES）和全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）。這些方法可以幫助鑒定患者基因組中的突變和變異。

數(shù)據(jù)分析和解讀：實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，識(shí)別患者基因組中的變異和突變。這需要專業(yè)的生物信息學(xué)分析和專業(yè)知識(shí)，以確保結(jié)果的正確性和全面性。

結(jié)果報(bào)告：實(shí)驗(yàn)室會(huì)生成基因檢測報(bào)告，概述患者的基因組變異和突變。這些報(bào)告通常由遺傳學(xué)家或臨床醫(yī)生解讀，并與患者和家庭分享。

遺傳咨詢和治療建議：基于基因檢測結(jié)果，患者和家庭可以接受遺傳咨詢，并獲得治療和管理建議。這可能包括行為療法、藥物治療或其他支持措施。

總的來說，自閉癥基因檢測需要綜合運(yùn)用臨床評估、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和專業(yè)知識(shí)，以確保正確和全面的結(jié)果，并為患者提供賊佳的治療和支持。